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为了探讨抑制人胃癌细胞核糖核酸酶Ⅲ家族成员Drosha蛋白的表达对胃癌HGC-27细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响及其与转染效率浓度梯度依赖的关系,本研究通过质粒构建的方法,采用Crispr-Cas9基因编辑网站设计针对敲除人Drosha基因的单guide RNA (gRNA)序列;利用转染试剂Lipo2000浓度梯度(2μL, 3μL, 5μL)依赖的方式将单g RNA质粒及阴性对照转染入胃癌HGC-27细胞中;利用实时荧光定量PCR (qPCR)检测阴性对照细胞和以Lipo2000浓度梯度依赖的g RNA细胞的Drosha基因表达情况;利用蛋白质免疫印记Western blotting检测不同浓度处理组Drosha蛋白的表达情况;采用CCK8法检测阴性对照细胞和以Lipo2000浓度梯度依赖的g RNA细胞的增殖能力;采用Wound healing实验比较阴性对照细胞和以Lipo2000浓度梯度依赖的g RNA细胞的迁移能力;利用Transwell TM实验比较阴性对照细胞和以Lipo2000浓度梯度依赖的g RNA细胞的侵袭能力。成功设计针对敲除人Drosha基因的单Guide RNA (gRNA)序列;与对照组相比,实验组成功抑制了人胃癌HGC-27细胞Drosha的基因及蛋白表达,增殖能力无明显改变(p0.05),但是抑制了人胃癌细胞HGC-27的迁移和侵袭能力(p0.05),其中当Lipo2000浓度为3μL时,转染效率最高,迁移和侵袭抑制率也最明显。表明了抑制Drosha基因在人胃癌HGC-27细胞中的表达量,可以以Drosha表达量依赖的方式抑制细胞的迁移和侵袭。本研究有助于为胃癌的早期诊断和与治疗提供新的分子靶标。 相似文献
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为探讨GPER基因的活化对人乳腺癌相关成纤维细胞(CAF)有氧糖酵解的影响,本研究构建GPERsi RNA慢病毒,转染CAF细胞,以构建GPER敲低的稳定细胞系;对照组(CAF-shNC)和GPER-shRNA慢病毒感染组(CAF-shGPER组),经嘌呤霉素筛选后,实时荧光定量PCR和蛋白印迹法检测GPER的m RNA及蛋白的表达;用GPER特异性激动剂G1 (1μmol/L)处理以上两组细胞,得到G1+CAF-shNC和G1+CAFsh GPER,应用蛋白印迹法分别检测以上4组细胞中GPER下游基因p-PKA和p-CREB的表达;采用实时荧光定量PCR和蛋白印迹法检测CREB糖酵解相关靶基因PDK4和LDHB的表达,应用葡萄糖、乳酸检测试剂盒检测4组细胞中葡萄糖消耗,乳酸生成情况。最终,成功构建GPER敲低的CAF稳定细胞系;GPER特异性激动剂G1可明显上调CAF-shNC组中GPER mRNA和蛋白水平;G1+CAF-shNC与CAF-shNC和G1+CAFsh GPER组相比,GPER下游基因PKA和CREB的磷酸化水平显著增加(p<0.05);CREB糖酵解相关靶基因PDK4和LDHB的mRNA和蛋白水平明显上调(p<0.05);葡萄糖消耗量和乳酸生成量明显增加(p<0.05)。由此可得,在人乳腺癌相关成纤维细胞中,GPER特异性激动剂G1活化GPER促进CAF的有氧糖酵解。 相似文献
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该文主要探讨Mirtron类micro RNA6894-5p过表达对胃癌细胞迁移、侵袭和增殖的影响。将miRNA6894-5p的模拟物分别转染进入胃癌MGC803和SGC7901细胞中,构建miRNA6894-5p过表达的细胞系;实时荧光定量PCR测miRNA6894-5p的RNA表达;Transwell实验检测细胞迁移侵袭能力;Cell Counting Kit 8实验检测细胞的增殖能力;荧光素酶报告基因实验检测miRNA6894-5p与肝配蛋白A3的靶向关系;实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法进一步检测miRNA6894-5p过表达后EFNA3的m RNA和蛋白的变化。结果显示,成功构建miRNA6894-5p过表达模型的胃癌细胞系;与相应阴性对照组相比,过表达miRNA6894-5p可提高细胞迁移侵袭能力(P0.05)和增强细胞增殖能力(P0.05);荧光素酶报告基因实验证实,miRNA6894-5p靶向作用于肝配蛋白A3,过表达miRNA6894-5p后肝配蛋白A3的m RNA及蛋白水平显著下降(P0.05)。该研究结果显示,Mirtron类miRNA6894-5p在人胃癌细胞中过表达可促进胃癌细胞的迁移、侵袭和增殖。 相似文献
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