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为提高重组人心房利钠肽(Atrial natriuretic peptide,ANP)的表达量,将3个ANP通过赖氨酸(Lysine,K)串联,并构建相对应的重组表达载体p ET28a(+)/ANP3。转染大肠杆菌进行诱导表达,目的蛋白约占菌体总蛋白的60%。经过包涵体变复性,赖氨酸酶(Lys-C)和羧肽酶(CPB)水解,以及一系列层析纯化,每升培养液可获得约16 mg的ANP蛋白。最终,纯化后的ANP经UPLC及Tricine SDS-PAGE鉴定,纯度大于90%,LC-MS鉴定显示其分子量为3 080 Da,且为二硫键正确形成的ANP单体,通过ELISA试剂盒检测,其具有和参比品一致活性。本研究为ANP的大规模制备打下了基础。同时,所采用的串联表达技术也为其他多肽类药物的重组表达提供了新的思路。 相似文献
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蛋白内肽酶AspN是一种锌金属内切肽酶,能选择性切割天冬氨酸的N端肽键,广泛应用于蛋白的多肽制备及质量肽图谱鉴定。目前内肽酶AspN来源于细菌分泌,产量低,制备困难,成本高,极大地限制了该酶的应用。将脑膜脓毒性黄杆菌分泌的蛋白内肽酶Asp N所对应的基因克隆入表达载体p ET32a,导入E.coli BL21(DE3),首次运用原核表达系统进行可溶性融合表达,亲和层析对重组蛋白进行纯化。用HPLC、SDS-PAGE和荧光底物Anthranilyl-Ala-Phe-Ala-Phe-Asp-Val-Phe(NO2)-Tyr-Asp对重组酶进行酶活鉴定。结果表明重组的内肽酶Asp N具有与标准品基本一致的酶切活性,能够较好地应用于生物和制药领域。 相似文献
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酿脓链球菌来源的免疫球蛋白G降解酶 (immunoglubulin G-degrading enzyme of Streptococcus pyogenes, IdeS) 是一种典型的半胱氨酸水解酶,可以在抗体铰链区的特定位点进行酶切,使IgG水解为完整的 F(ab)2片段和Fc片段,由于其独特的酶活特异性和高活性,IdeS可以作为工具酶应用于IgG的亚单位制备、结构分析及表征分析.利用双标签 (GST-tag及His6-tag) 表达系统在E.coli中高效表达了可溶性重组蛋白酶GST-IdeS-His6,并在IdeS的氨基端与GST之间加上肠激酶酶切位点,以利于标签的去除.再利用亲和层析的纯化方法对目的蛋白进行纯化.使用SDS-PAGE、HPLC-SEC、LC-MS对纯化后的IdeS进行分析和鉴定.结果表明:本系统所表达的蛋白酶IdeS得率高,每1L菌液纯化可获得约25mg纯度为90%以上的蛋白酶IdeS,将此蛋白酶与抗体IgG以1:100 (m/m) 比例混合,于37℃反应30min,即可酶切完全.能够满足蛋白质结构分析中对蛋白酶的高质量要求,并且适用于抗体类药物的表征分析.同时,蛋白酶IdeS也可以应用于生物仿制药、生物改良药和新一代抗体以及Fc-融合蛋白的研究. 相似文献
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