棉花抗枯萎病相关ERF-B3亚组转录因子的克隆与表达

以拟南芥ERF-B3亚组转录因子的AP2/ERF结构域为探针,利用NCBI中的棉花(Gossypium hirsutum)EST数据库,通过电子克隆结合RT-PCR方法,从枯萎病菌诱导后的高抗枯萎病品种‘中棉所12’克隆到1个与抗枯萎病相关的ERF-B3亚组转录因子基因GhB301。序列分析结果显示,GhB301基因cDNA全长593 bp,开放阅读框384 bp,编码127个氨基酸,含有一个保守的AP2/ERF结构域。实时荧光定量PCR检测该基因的表达显示,枯萎病菌诱导后,GhB301基因在棉花根中、抗病品种中优势表达;在乙烯、水杨酸、干旱、低温及高盐的诱导下表达量均发生变化。研究结果表明,GhB301基因可能参与了棉花对病原菌、激素及非生物胁迫的应答反应。     

棉花种子活力劣变的差异蛋白质组学研究

该研究以新疆本地审定且大面积推广应用的陆地棉品种‘新陆早33’、‘新陆早36’、‘新陆早50’种子为研究材料,采用高温高湿(40℃,RH100%)人工老化方法获得不同活力种子,双向电泳分离‘新陆早50’活力劣变种子总蛋白并对差异蛋白点进行二级质谱(MALDI-TOF/TOF)鉴定分析,以明确棉花种子活力劣变过程中蛋白质组表达的变化,探讨棉花种子老化的分子机制。结果显示:(1)经人工老化获得不同活力水平的种子,经生活力检测发现‘新陆早50’的种子活力随老化时间的延长呈线性下降,可作为蛋白质组研究材料。(2)TCA-丙酮法分别提取‘新陆早50’对照和劣变种子的总蛋白,经2-DE分离,获得了分辨率和重复性较好的蛋白质组差异表达图谱,在等电点4~7、分子量14.4~97.4kD之间发现约350个肉眼可辨的蛋白点,其中上调2倍以上且达到99%统计学显著水平的差异表达蛋白点30个。(3)二级质谱分析发现,有29个蛋白点被成功鉴定,生物信息学分析和功能分类结果表明,与贮藏相关的蛋白有13个,免疫相关蛋白2个,脂代谢相关蛋白1个,能量代谢相关蛋白1个,肌动蛋白2个,功能未知蛋白5个,调控相关蛋白2个,次级代谢物1个,细胞修复防御相关蛋白1个,分泌性蛋白1个。研究认为,分离鉴定的29个差异蛋白的变化可能与棉花种子活力劣变有关。     

海岛棉GbRLCK10基因克隆及表达分析

该研究以拟南芥抗逆基因At1g67520为探针,利用海岛棉ESTs数据库,通过电子克隆获得海岛棉RLCK家族基因GbRLCK10,解析该基因组结构,并结合qRT-PCR技术分析该基因mRNA的组织表达特征以及在不同胁迫诱导下的表达模式,为揭示RLCK家族基因在海岛棉中的表达调控及作用机制提供理论依据。结果显示:(1)获得海岛棉类受体胞质激酶(RLCK)基因,其开放阅读框(ORF)为1 179bp,编码392个氨基酸,具有典型的Serine/Threonine结构域,属于RLCK家族,与GaRLCK10(XP_017604046.1)亲缘关系较近,命名为GbRLCK10(登录号2022184),且该基因由5个外显子和4个内含子组成。(2)实时荧光定量(qRT-PCR)检测显示,GbRLCK10基因在抗病品种‘新海21’和感病品种‘新海14’的根、茎、叶中均有表达;当黄萎病菌诱导后,GbRLCK10基因在抗病品种中对于病原菌的响应时间早于感病品种,且对黄萎病菌响应更强烈,推测该基因参与棉花对黄萎病的响应;盐(NaCl)、干旱(PEG-6000)处理‘新海21’后,GbRLCK10基因在NaCl处理下响应时间要早于PEG-6000处理,但对PEG-6000处理响应更强烈;分别用4种激素处理‘新海21’后,GbRLCK10均能被诱导表达,且在水杨酸(SA)处理后表现为先增加后下降再增加趋势,在乙烯(ET)处理后表达量为持续上升趋势,在茉莉酸甲酯(MeJA)处理后呈先升高然后下降的趋势,但GbRLCK10基因对赤霉素(GA3)响应不明显。研究表明,GbRLCK10基因具有RLCK基因家族典型特征,该基因随黄萎病菌、NaCl、干旱、激素处理时间推移而发生变化,推测GbRLCK10基因可能参与了棉花对黄萎病菌、NaCl、干旱、激素胁迫的应答反应,但其功能仍需进一步研究。     

棉花GhWRKY44基因的克隆与表达分析

该研究以枯萎病菌诱导棉花根部基因表达谱中筛选得到的WRKY基因片段为探针,通过电子克隆结合RT-PCR技术,从高抗枯萎病品种‘中棉所12’中克隆到1个与抗枯萎病相关的WRKY转录因子基因GhWRKY44(GenBank登录号KJ801807)。序列分析表明,GhWRKY44基因开放阅读框1 197bp,编码398个氨基酸,含有2个WRKY结构域及C2H2型锌指结构,属于棉花WRKY转录因子家族第Ⅰ类;系统进化分析显示,GhWRKY44基因与拟南芥AtWRKY44亲缘关系最近。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测该基因表达特性,结果发现枯萎病菌诱导后,GhWRKY44基因在抗病品种中优势表达,随处理后时间的推移,其表达量呈先增加后降低再增加的变化趋势,处理后3h时GhWRKY44基因表达量达到最大;而在感病品种中,GhWRKY44基因表达水平明显低于抗病品种,对病原菌响应时间也晚于抗病品种,处理后6h时GhWRKY44基因表达量才达到最大。水杨酸和茉莉酸均能诱导GhWRKY44基因的表达,水杨酸诱导后,GhWRKY44基因表达量迅速增加,且其表达量一直维持在一个较高水平;而茉莉酸诱导后,GhWRKY44基因表达量呈先增加后降低的变化趋势,且其表达水平明显低于水杨酸诱导。研究表明,GhWRKY44基因可能参与了棉花对病原菌和激素胁迫的应答反应。