一种具有纤溶活性的枯草杆菌蛋白激酶的研究──Ⅰ高产酶菌株的筛选与鉴定

本文主要阐述了一种具有纤溶活性的枯草杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）蛋白激酶产生菌株的筛选与鉴定的研究结果。作者从初筛的１２株Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｌｉｌｉｓ菌中,通过对固体发酵和液体发酵所产生的枯草杆菌蛋白激酶,用琼脂糖－纤维蛋白平板法测其活性,经比较不同菌株的活性,筛选出两株高产酶菌株：Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＨＷ—１２和Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＨＷ—３。同时对菌体和菌落形态特点、生理生化反应进行了鉴定,认为Ｂ．ＳｕｂｔｉｌｉｓＨＷ－１２菌株可用来做为发酵生产该酶的菌种。     

美洲拟鲽抗冻蛋白基因（afp）导入番茄的研究

将整合在Ｔｉ质粒上的ａｆｐ基因供体ＤＮＡ,用花粉管通道和子房注射方法导入番 茄品种“中蔬四号”中,对Ｄ１、Ｄ２代进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交获得杂交带;田间抗寒性试验表明,在春季平均气温低于正常年份４．４℃条件下,转基因组植株生长势优于对照;致死温度也比对照降低２℃、说明ａｆｐ基因已整合转化番茄基因组并获得表达。     

美洲鲽抗冻蛋白基因的亚克隆及构建转基因鱼的表达载体

用限制性内切酶Ｐｓｔ Ｉ部分消解含有美洲鲽抗冻蛋白基因的ｐＣＴ５质粒,分离得到３２４ｂｐ的片段,将此片段亚克隆到ｐＵＣ１９质粒中,筛选到ｐＵＣ－ＡＦ重组子。从ｐＵＣ－ＡＦ重组子中,用ＢａｍＨＩ和ＨｉｒｄⅢ切下３２４ｂｐ的抗冻蛋白基因,再重组到含有ＳＶ４０病毒启动子的ｐＫＳＶ－１０的载体中,构建成转基因鱼的表达载体,此表达载何可用于鱼的基因转移的研究。     

甲醇酵母基因表达系统的研究进展

在大肠杆菌这一传统表达系统被频繁用作研究各种基因表达时,一种新型且有效的基因表达系统－甲醇酵母正逐渐引起人们的注意。本文对甲醇酵母基因表达系统的特点及研究进展作一简要综述。     

鲤鱼生长激素基因的改造及其在大肠杆菌中的表达

用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）改造了锂鱼生长激素基因,扩增出编码锂鱼生长激素成熟肽的序列,并将此序列克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ⅱ ＫＳ质粒中,序列分析后,亚克隆到大肠杆菌表达载体ｐＢＶ２２０中。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和薄层扫描,结果表明锂鱼生长激素基因已大肠杆菌中获得表达。锂鱼生长激素成熟肽的分子量为２２０００道尔顿,表达率占细胞总蛋白的１８％以上％。     

鲤鱼生长激素基因的PCR扩增、克隆及其序列比较

从鲤鱼(Cyprinus carpio)脑垂体中分离其总RNA,经反转录成为第一条链cDNA。以第一条链cDNA为模板,以合成的两段29个寡聚核苷酸为引物,再经过PCR扩增,合成了鲤鱼的生长激素基因,并把其克隆到大肠杆菌表达载体(P^{blue-ocripx Ks+/-})上。序列分析和限制酶切图谱表明所克隆的鲤鱼生长激素基因的开放读框含有630bp,编码210个氨基酸,其中含有22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟GH序列。我们所克隆的鲤鱼GH基因与Koren发表的鲤鱼GHcDNA的序列在编码区完全一致,但是与chao发表的鲤鱼GHcDNA比较,在编码区核酸序列和氨基酸序列的同源性分别为95．6％和96．7％。     

鲤鱼生长激素基因在鲫鱼中的基因转移及PCR检测

鲫鱼群体内,个体之间的生长速度差别不大,遗传保守性较强,用常规育种方法很难获得生长速度快、个体差异较大的后代。通过基因转移技术,将外源基因如鱼的生长激素基因导入鱼的受精卵中,而获得转基因鱼是钱定向育种的一条有效途径。已有报道,在虹鳟鱼生长激素cDNA上游连结一个病毒启动子构建成表达质粒,由此获得的转基因鲤鱼比对照生长速度快20％。但是未见有将鲤鱼生长激素基因导入鲫鱼受精卵的报导。我们克隆了鲤鱼生长激素基因,并用它构建了含有病毒启动子（F.1,插入0．8Kb,位于XbaI和PstI之间)的表达质粒（Fig.2,命名为pCMV－TK－CGH）。用该质粒对鲫鱼受精卵进行注射,注射了1000粒卵,获得了转基因实验鲫鱼480尾。孵化率为48％。将其中100尾幼鱼于水簇箱中进行放养。选择其中个体较大的50尾进行PCR检测。其中8条鱼的基因组DNA有0．6Kb的PCR扩增产物（Fig.3),表明其上整合有外源的鲤鱼生长激素基因,其整合率为16％。其中最大的一条体重4．2g,体和6cm,比对照（0．7g,4cm）体重增加5倍,体长增加2cm(Fig.4)。我们构建的是高效表达质粒,其上含有巨细胞病毒增强子和人单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子（属强启动子）,对鲤鱼生长激素基因有较强的启动作用。鲤鱼和鲫鱼在分类上属同科不同属,考虑到两者生长激素基因有较强的启动作用。鲤鱼和鲫鱼在分类上属同科不同属,考虑到两者生长激素基因的同源性,对转基因鲫鱼的PCR检测参照了加拿大学者Du所用引物的设计、使注射的外源基因与其本身的内源生长激素基因相区别。我们的转基因整合率（16％）与Zhang(10%)、Grass和Hackett等报道的接近。转基因鲫鱼生长速度增加的倍数（5倍）与Du等人的结果（2－6）接近。但是,这一生长速度快的优势能否遗传给后代,有待进一步观察。     

DNA的重组技术(Ⅳ) 真核细胞高分子量DNA的提取

(一)从离体培养的细胞中提取 1.吸去培养液,用4℃预冷的Tris—生理盐水缓冲液洗细胞1次。Tris—生理盐水的配制是NaCl3g,KCl0.68g,Tris3g,溶于重蒸水,用1N HCl调至pH7.4,加重蒸水到1000毫升。高压蒸汽灭菌15磅,20分钟,贮于4℃。