柯萨奇病毒B组3型VP1基因的体外表达鉴定

将克隆的CVB3 VP1基因亚克隆至真核表达载体pCEP4构建CVB3 VP1的真核表达质粒pCEP4-CVB3VP1.pCEP4-CVB3VP1转染HeLa细胞,蛋白印迹试验证明该表达体系可以在体外表达能为CVB3中和抗体识别的VP1蛋白.本研究为CVB基因疫苗的研究提供了实验依据.     

柯萨奇病毒B3型3D蛋白抗体的制备

肠道病毒3D蛋白是其RNA聚合酶。柯萨奇病毒B3型(coxsackievirus B3,CVB3)主要感染心脏,其3D蛋白在心肌表达中的时序和分布尚不清楚。本研究将通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)获得的CVB 3D片段插入pET28a(＋)的表达框,获得pET28a(＋)-3D重组质粒。异丙基 β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导pET28a(＋)-3D表达3D-His蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)后,切胶,获得3D-His蛋白。3D-His蛋白加佐剂免疫新西兰大白兔制备3D蛋白多克隆抗体,蛋白免疫印迹法检测抗体效价及特异性。结果显示,本研究获得了高效价且特异性好的抗CVB3 3D蛋白抗体,可用于CVB3 3D蛋白功能的后续研究。     

表达红荧光蛋白的重组柯萨奇病毒B组3型基因组稳定性分析

本文旨在分析含红荧光蛋白mCherry基因的重组柯萨奇病毒B组3型（coxsackievirus B3,CVB3）基因组的稳定性。用重组质粒pCVB3-mCherry转染HeLa细胞,观察细胞病变和mCherry的表达。收获病毒后,用噬斑实验纯化病毒并测定病毒毒力。将重组病毒CVB3-mCherry在HeLa细胞中连续传代,提取第2~6代重组病毒总RNA,经反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增出报告基因mCherry及CVB3部分序列,进行测序分析。结果表明, CVB3-mCherry转染的HeLa细胞出现细胞病变并表达红荧光蛋白mCherry;从第2代开始, CVB3-mCherry出现报告基因mCherry及部分CVB VP4基因序列丢失,基因序列丢失导致病毒开放读码框架移位。本研究表明,mCherry基因序列的插入导致CVB3基因组不稳定,随着病毒的传代逐渐丢失插入的报告基因mCherry及CVB3基因组的部分序列,病毒读码框移位,产生致死性突变株。因此,应用CVB3-mCherry时,病毒的传代次数应不超过2代,否则应重新从重组质粒中收获病毒,并对每代重组病毒进行纯化和毒力测定。     

H9c2细胞对B组柯萨奇病毒3型重组株的易感性

H9c2细胞是来源于大鼠胚胎心脏组织的成肌细胞系,B组柯萨奇病毒(group B Coxsackievirus,CVB)是心肌炎和扩张型心肌病的主要病原.本研究观察了CVB3在H9c2细胞中的感染性,探讨H9c2细胞是否可用于CVB致心肌疾病的实验研究.用整合了增强型绿色荧光蛋白(EGFP)或海肾荧光素酶(RLuc)的...