荧光热漂移实验体外检测核小体的解聚

核小体是真核生物染色质的基本组成单元。核小体的解聚可以动态调控诸如DNA复制、转录、重组等以DNA为模板的生物学过程。特定荧光探针分子与蛋白质疏水残基结合后可被激发荧光信号。荧光热漂移（fluorescence thermal shift,FTS）是一种利用该原理检测温度上升时蛋白质变性过程的方法。本文以Widom 601序列为DNA模板,盐透析法体外装配核小体;分别在实时荧光定量PCR仪的VIC和TAMRA通道激发下,利用FTS检测了核小体在Tris-NaCl（TN）缓冲液和HEPES缓冲液中的解聚状态。研究结果发现,DNA对照序列在TN缓冲液中产生的背景噪声较大,VIC通道激发下组蛋白八聚体产生的荧光信号相对较强。FTS检测核小体的结果显示,随着温度的上升核小体的解聚过程分为2个阶段,～71℃和～84℃是核小体解聚速度最快的温度范围,而75℃～80℃是降解速度较慢的阶段。基于FTS基本原理,本研究发展了一种新颖的可用于检测核小体结构稳定性的方法,为核小体与染色质结构相关问题的研究奠定了一定的技术基础。     

长白山林蛙输卵管糖蛋白ROGP-Ⅲ的分离纯化及鉴定

通过正交试验确定最佳的粗提工艺,并将林蛙输卵管水提液先后通过盐析,透析,阴离子交换层析、阳离子交换层析和葡聚糖凝胶过滤层析,获得了一种分子量大小约为66 kD的单一蛋白,高碘酸-Schiff试剂法鉴定其为糖蛋白。经HPLC分析,纯度为97.2%,将其命名为ROGP-Ⅲ,经PNGase F糖苷肽酶处理后推测其糖含量约为17%。     

酿酒酵母核小体定位理论模型的体外实验验证

核小体定位对真核生物基因表达调控发挥着重要作用。前期基于核小体核心及连接区域的k-mer频次分布偏好性,构建了位置权重矩阵算法,并在酿酒酵母基因组内较好地预测了核小体占据率。利用该理论模型,以1 bp碱基为步长、147 bp碱基为窗口,用该算法计算了酵母1号、3号、14号染色体上核小体形成能力强、中、弱各3条长度为147 bp的DNA序列,将这些片段克隆到重组质粒中,大量扩增回收9条标记biotin分子的目的序列。同时分别表达纯化了组蛋白H2A、H2B、H3和H4,复性后装配形成组蛋白八聚体结构。利用盐透析方法将9条DNA序列在体外组装形成核小体结构,经biotin标记检测后计算了反应过程的吉布斯自由能,对比了9条目的序列形成核小体的亲和力大小。研究发现,9条序列中有5条序列与理论预测完全符合,4条序列与理论预测不完全一致。实验结果与该算法预测的核小体定位结果基本一致,表明该理论模型能够有效预测酿酒酵母基因组核小体占据水平。     

大鼠Mocs2基因跳跃型外显子可变剪接保留率的检测

可变剪接是真核生物基因表达调控的一种重要方式,它通过剪接位点调控ORFs (Open reading frames)区域外显子或内含子的表达,产生不同的mRNA剪接体,进一步翻译成具有相同或不同功能的蛋白质,从而对诸如发育、疾病、环境响应等生物学过程产生重要影响.已有文献报道,人类Mocs2基因exon 1a与exon 1b外显子发生互斥型可变剪接,产生的两个剪接体分别编码钼喋呤合酶的大小亚基,参与钼辅因子生物的合成过程.基于本课题组前期大鼠肺部组织RNA-seq测序的结果,发现Mocs2基因2号外显子转录后可被剪接或保留,产生两个不同的剪接体.为验证测序结果的准确性,本研究利用半定量PCR与实时荧光定量PCR两种方法检测大鼠脑、海马、肺组织中Mocs2基因2号外显子的保留率.半定量PCR方法检测大鼠肺、海马、大脑组织中Mocs2基因的保留率分别为(88.28±3.09)％、(99.44±0.24)％、(99.54±0.19)％.实时荧光定量PCR检测的保留率分别为(66.76±20.47)％、(75.60±12.44)％、(87.28±16.4)％.实验结果表明,Mocs2基因2号外显子在大鼠中存在可变剪接现象,且不同组织具有一定差异.本工作进一步验证了两种PCR方法检测前体mRNA可变剪接保留率的可行性.     

基于DMSP-OLS数据和可持续生计的中国农村多维贫困空间识别

贫困是人类在21世纪发展所要长期面对的困境,消除贫困是中国全面建成小康社会的最大挑战。单纯依据经济、社会统计数据对贫困状况的测度缺乏空间视角,无法直观地分析贫困状况的空间差异、地域特征及致贫原因的生态地理背景分异机制。引入脆弱性-可持续生计框架模型,构建了可持续生计的测度指标体系,以宁夏回族自治区所辖县区为样本,借助遥感和GIS空间分析技术,建立了2002年和2013年夜间灯光指数和可持续生计指数(SLI)间的回归模型,并以青海省所有县区的数据对模型进行了验证。利用检验后的模型将持续生计指数空间化;采用空间自相关分析了县域持续生计指数的空间集聚状况。结果表明:2002年和2013年估算的SLI平均相对误差为10.84%和12.19%,精度较高。中国所有县区SLI的全局Moran's I值分别为0.636和0.579,具有较高的空间依赖性,"低-低"型贫困区域即空间贫困陷阱区集中在扎兰屯-百色一线以西。两时点上分别识别出642个、612个多维贫困县。2013年,多维贫困县区在空间上表现为东、中、西部岛状、块状、连片状3种地域类型。研究发现夜间灯光数据是一种有效的空间贫困测度数据源,可实现数据缺乏地区大尺度上的多维贫困动态监测。     

体外装配核小体过程组蛋白浓度依赖的动力学模型

为探索组蛋白浓度对核小体体外装配的影响,本研究表达纯化了4种组蛋白,通过控制实验反应体系中组蛋白的浓度,利用盐透析法在体外装配了核小体,检测分析了组蛋白浓度与核小体组装效率的关系。以此实验数据为基础,提出了核小体组装过程组蛋白浓度依赖性的动力学模型。实验结果发现,反应体系中组蛋白浓度与核小体生成量呈典型的线性关系。依据动力学理论模型,进行线性回归拟合,回归系数达到0.963;经计算601 DNA序列组装核小体的反应速率常数k为1.49×10^-5mL·h·μg^-1。CS1序列验证动力学模型的线性回归相关系数为0.989,反应速率常数为1.52×10^-5mL·h·μg^-1。该实验方法及动力学模型中反应速率常数k可用于评价相同长度的DNA序列组装核小体的能力、组蛋白与其突变体以及组蛋白变体之间形成核小体结构能力的差异。该动力学模型的建立为理解核小体装配、核小体定位、染色质结构等相关问题提供了理论指导。     

三种快速制备含重复序列质粒PCR模板的方法

为了探索含重复序列质粒PCR模板的快速简易制备方法,分别利用高速离心法、TE煮沸法和TE/SDS煮沸法处理过夜培养的含重组质粒大肠杆菌菌体,制备模板后进行PCR扩增发现,均能得到比较清晰的目的条带,可以用于含重复序列质粒的初步鉴定。相比较而言,高速离心5 min、TE煮沸3 min、TE/SDS煮沸2.5 min制备的样品PCR扩增后效果较好。这3种方法快速、简便、费用低、无污染,简化了PCR模板制备的过程,为重组质粒大量筛选鉴定的研究奠定了基础。     

球状脂联素在波动性高血糖诱导人脐静脉内皮细胞凋亡中的作用

目的球状脂联素在波动性高血糖诱导人脐静脉内皮细胞凋亡中的作用。方法在不同条件下体外培养人脐静脉内皮细胞,分别或联合加入球状脂联素(gAD)、单磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMPK)的激活剂AICAR和AMPK的阻滞剂araA。采用MTT比色法测定细胞活性,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot检测AMPKα和磷酸化AMPKα蛋白表达。结果分别与对照组和恒定高血糖组比较,波动性高血糖显著抑制细胞活性和增加细胞凋亡率。gAD明显抑制波动性高血糖诱导的细胞凋亡。AICAR和gAD可明显激活AMPK的表达。araA可明显抑制gAD诱导的AMPK蛋白表达。结论波动性高血糖比恒定性高血糖更易促进内皮细胞凋亡,gAD明显抑制波动性高血糖诱导内皮细胞凋亡,其机制可能与激活AMPK有关。     

利福平致小鼠肝细胞坏死与受体相互作用蛋白1有关

目的探讨利福平(RIF)致小鼠肝细胞坏死是否存在程序性细胞坏死,是否与受体相互作用蛋白1(RIP1)有关。方法成年雄性昆明鼠随机(随机数字法)分为4组,对照组(C)、RIF组、苄氧羰酰-缬氨酰-丙氨酰-天冬氨酰-氟甲基酮(zVAD)组和Nec-1组,所有组别均处理动物7d。HE染色观察肝细胞形态学变化。免疫组化、免疫印迹和实时荧光定量PCR方法检测各组小鼠肝脏RIP1的表达。结果与RIF组比较,Nec-1组显著减轻肝细胞的坏死,并且显著减少RIP1的表达(P0.05),而zVAD组RIP1的表达没有统计学差异(P0.05)。结论 RIF致小鼠肝细胞坏死与程序性细胞坏死有关,与RIP1表达增强有关。用程序性坏死的特异性抑制剂Nec-1,阻断RIP1的表达,可显著减轻肝细胞坏死,可能为预防RIF致肝细胞坏死提供了一个新思路。     

一种从酵母细胞中提取组蛋白的方法

为了制备体外酵母DNA序列组装核小体所需的组蛋白,利用酸抽提方法从未经饥饿处理和经过不同时间饥饿处理的酿酒酵母细胞中分离组蛋白,经SDS-PAGE电泳分析和Bradford法测定蛋白浓度,发现抽提物中含有组蛋白H1、H2A、H2B、H3和H4,电泳条带位置正确、纯度较高,正常细胞的抽提物中蛋白总量达到158 μg/mL.试验结果表明该方法可以提取出较高质量的酿酒酵母组蛋白.