霍乱毒素B亚单位工程菌MM2在含乳酸培养基中的高表达

确定了工程菌MM2中霍乱毒素B亚单位(CTB)在含乳酸培养基中的高表达方案。采用两阶段控制培养温度(30℃→37℃)可提高CTB产量4倍,提高后期pH值(72→84)可提高CTB比表达水平214倍,中间补加乙酸钠可提高CTB产量65%。在5L发酵罐培养菌密度OD₆₀₀达30,CTB产量达1867mg/L,产物在培养液中以多聚体形式存在,具有抗原性。     

包埋法固定微生物细胞技术的新进展

自六十年代固定化酶技术问世以来,固定化细胞技术随之迅速发展。到了七十年代,作为酶源的微生物菌体本身的固定化又引起人们极大兴趣,其研究和应用已涉及食品、化工、医药、环境保护等领域。目前,工业化生产上采用的固定化方法主要有两大类:吸附法和包埋法。微生物菌体的固定化一般采用包埋法。其优点是:(1)微生物菌体包埋在聚合物中不易漏出;(2)操作条件温和、对外界环境的缓冲作用大;(3)可防止微生物菌体的机械损伤,易于再生,产物分离提取容易。 载体的性能影响固定化细胞的机械强度、细胞活性、工作稳定性,因此,载体的选择及其制备方法一直     

碳源和IPTG诱导对工程菌MM2表达CTB的影响

研究了不同碳源如葡萄糖、乳酸和乙酸以及IPTG诱导对工程菌MM2表达霍乱毒素B亚单位(CTB)的影响。在YC培养基中分别加入0.048mol/L的葡萄糖、0.102mol/L的乳酸和0.167mol/L的乙酸,它们在完全氧化后可产生相同的能量。结果表明,加入葡萄糖会大幅度降低ctb基因的表达水平,其原因和培养过程中pH值下降有关;加入乳酸可提高ctb基因表达水平1.15倍,且不抑制菌体生长;加入乙酸可提高ctb基因的表达水平0.9倍,但对菌体生长有抑制作用。不同时间及不同浓度的IPTG诱导未能提高ctb基因的表达水平,说明lac启动子对ctb基因的表达没有影响或影响很小。     

霍乱毒素B亚单位工程菌MM2的表达与lac启动子的关系

研究了不同碳源(葡萄糖、乳酸和乙酸)以及IPTG诱导对工程菌MM2表达霍乱毒素B亚单位(CTB)的影响,ctb基因位于lac启动子的下游。在YC培养基中分别加入0.048mol/L的葡萄糖、0.102mol/L的乳酸和0.167mol/L的乙酸,它们在完全氧化后可产生相同的能量。结果表明,加入葡萄糖会大幅度降低ctb基因的表达水平,其原因和培养过程中pH值下降有关;加入乳酸可提高ctb基因表达水平1.15倍,且不抑制菌体生长;加入乙酸可提高ctb基因的表达水平0.9倍,但对菌体生长有抑制作用。不同时间及不同浓度的IPTG诱导未能提高ctb基因的表达水平,说明lac启动子对ctb基因的表达没有影响或影响很小。     

从织锦芋螺中克隆α芋螺毒素序列

为了从我国南海产织锦芋螺（Ｃｏｎｕｓｔｅｘｔｉｌｅ）中分离新的毒素序列并研究其应用价值,进行了织锦芋螺毒素基因的分离工作．从织锦芋螺毒管中提取ｍＲＮＡ,以Ａ族芋螺毒素的信号肽编码部分和３′端非翻译部分的保守序列为引物,通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增和序列分析方法获得新的芋螺毒素序列．结果得到两种不同的α芋螺毒素序列,两者都属于α４／７亚型芋螺毒素,预测其成熟肽序列分别为Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ（Ｃ端Ｇｌｙ可能被酰胺化）和Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ－Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ａｒｇ．采用传统的生化分离手段尚未从织锦芋螺中获得过α芋螺毒素序列,这两种α芋螺毒素作用的种属特异性、受体类型特异性和在小细胞肺癌的诊断和治疗中的应用价值有待进一步研究