鸡髓样分化因子88的原核表达及单克隆抗体制备

目的:克隆、表达、纯化鸡髓样分化因子88(MyD88),制备其单克隆抗体。方法:从脾脏cDNA中扩增857bp的MyD88基因片段,插入pMAL-c5X表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)获得表达菌株,IPTG诱导表达,用SDS-PAGE分析MBP(麦芽糖结合蛋白)-MyD88重组融合蛋白的表达,切胶纯化目的蛋白;免疫BALB/c小鼠,制备针对MyD88的单克隆抗体,Western印迹检测抗体特异性,制备腹水并进行抗体亚型鉴定和效价测定。结果:构建了鸡MyD88原核表达载体pMAL-MyD88,并在大肠杆菌中获得高表达,目的蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在;建立了3株抗鸡MyD88单克隆抗体细胞株,制备了腹水,亚型分别为IgG1、IgG1和IgG2a,轻链均为κ,腹水抗体的效价均为1∶2×105。结论:在原核表达系统中表达、纯化了重组鸡MyD88,制备了针对鸡MyD88的单克隆抗体,为后续的MyD88定量和功能研究奠定了基础。     

鸡MyD88-TIR的同源模建

髓样分化因子(MyD88)是Toll受体(TLR)信号通路中的一个关键接头分子,在传递信息和介导炎症反应中具有重要的作用。对鸡MyD88(Myeloid differentiation primary response protein MyD88)的TIR(Toll-interleukin1-resistance)区域进行同源建模,并评估其可用性,为进一步研究MyD88与TLR(Toll receptor)相互作用的原理奠定基础。通过结构域分析、模板相似性搜索和序列比对、初始建模、精修和动力学优化,立体化学结构和能量合理性评估,获得未知三维结构的鸡MyD88-TIR三维模型。结果表明,鸡MyD88包含DEATH和TIR两个结构域,所模拟的MyD88-TIR三维模型二面角构象和氨基酸能量分布以及主侧链立体化学特性合理。