蛋白质二硫键异构酶相关蛋白A的表达及性质的研究

克隆了Aspergillus niger T21中的蛋白质二硫键异构酶相关蛋白A（PRPA）基因,并将它插入pET23b表达载体。在E. coli中表达时,PRPA占菌体总蛋白的34%。经过超声破细胞、硫酸铵分级沉淀和离子交换层析获得了纯度大于90%的重组蛋白。PRPA有二硫键异构酶活性。在PRPA存在下,变性和还原的溶菌酶复性率和复性速度降低,电泳结果表明溶菌酶聚集增多。荧光结果表明PRPA表面有较多的疏水基团。     

一种自制T-载体的构建

TaqDNA聚合酶由于其具有非模板依赖型末端转移酶活性常使PCR产物的 3′末端形成一个dA突出。实验通过在pGEM 7Zf ( + )质粒的多克隆位点中插入少数新的酶识别位点 ,使其改造成为能被XcmI限制内切酶消化后可形成 3′末端具有一个dT突出的pGEMXT 载体 ,从而易于与具有 3′dA的PCR产物直接连接 ,并通过蓝白斑筛选而获得重组克隆。这种新构建的载体由于新添了相应的酶切位点还可用BamHI或HindIII单酶切出其中所插入的片断 ,方便了后续分析工作的进行。