COX-2的基因克隆和多克隆抗体制备

环氧合酶-2（COX-2）是一种具有多种功能的神经调节物质,它的许多功能细节仍不十分清楚,还需要进一步深入研究.用PCR技术从大鼠脑cDNA文库中,扩增到正常成年大鼠COX-2的cDNA序列,测序结果与已发表的序列一致.通过PCR扩增和基因重组,分别构建COX-2编码基因全长和羧基端部分编码序列的表达载体,并导入大肠杆菌DH5α中,通过IPTG诱导表达重组融合蛋白,结果导入全长编码基因表达载体的DH5α无COX-2融合蛋白表达,而羧基端部分基因编码的COX-2融合蛋白在DH5α中以包涵体的形式进行表达.经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,在相对分子质量（M_r）为44 000处有1条特异的蛋白质条带.对以包涵体形式表达的蛋白质进行变性、重折叠及纯化后,得到了高纯度融合蛋白.以重组融合蛋白免疫新西兰种大白兔,制作了抗COX-2多克隆抗体,经酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹和免疫细胞化学方法检测,此抗体具有较高效价和特异性.COX-2基因和多克隆抗体的获得,为进一步研究COX-2的功能创造了条件.     

成年转基因小鼠嗅鞘细胞的培养、纯化及生物学特性

已有多项研究表明,嗅鞘细胞具有修复中枢及外周神经损伤的潜能。我们选用了表达增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,eGFP)的成年小鼠,分离其双侧嗅球嗅神经纤维层及嗅小球层细胞,体外原代培养并予以纯化。同时结合共聚焦、相差显微镜,细胞增殖分析及免疫组织化学鉴定等技术,对其生物学活性进行研究。结果表明:(1)原代培养转基因成年小鼠嗅球嗅鞘细胞(Olfactoryensheathingcells,OECs)15d后,主要存在两种不同形态和免疫组织化学特征的细胞。一种是带有长突起的双极或多极OECs,表达P75~(NIR)(P75lowaffinityneurotrophicreceptor)S100和胶质原纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)。另一种则是对Thy1.1抗体免疫反应阳性,呈扁平或内皮样形态的成纤维细胞。(2)根据不同类型细胞在未覆层的培养器皿上贴壁速度的差异,我们建立了一种简单易行、不需任何抗体或昂贵仪器的细胞纯化方法,获得了大量高纯度的OECs。(3)在连续纯化培养22d后,OECs仍能保持较高的增殖活性。本实验支持和丰富了OECs发育的相关理论,为进一步体内移植修复CNS损伤提供了理想的材料。     

成年转基因小鼠嗅鞘细胞的培养、纯化及生物学特性

已有多项研究表明,嗅鞘细胞具有修复中枢及外周神经损伤的潜能。我们选用了表达增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,eGFP）的成年小鼠,分离其双侧嗅球嗅神经纤维层及嗅小球层细胞,体外原代培养并予以纯化。同时结合共聚焦、相差显微镜,细胞增殖分析及免疫组织化学鉴定等技术,对其生物学活性进行研究。结果表明：（1）原代培养转基因成年小鼠嗅球嗅鞘细胞（Olfactory ensheathing cells,OECs）15d后,主要存在两种不同形态和免疫组织化学特征的细胞。一种是带有长突起的双极或多极OECs,表达P75^NTR（P75 low affinity neurotrophic receptor）、S100和胶质原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）。另一种则是对Thy 1．1抗体免疫反应阳性,呈扁平或内皮样形态的成纤维细胞。（2）根据不同类型细胞在未覆层的培养器皿上贴壁速度的差异,我们建立了一种简单易行、不需任何抗体或昂贵仪器的细胞纯化方法,获得了大量高纯度的OECs。（3）在连续纯化培养22d后,OECs仍能保持较高的增殖活性。本实验支持和丰富了OECs发育的相关理论,为进一步体内移植修复CNS损伤提供了理想的材料。