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利用CRISPR/Cas9系统在基因FOXA2蛋白质编码区后插入绿色荧光蛋白核酸序列,实现对FOXA2基因开启和关闭的示踪。通过靶向序列选择、Cas9靶向质粒及Donor片段的克隆、细胞转染并进行流式细胞荧光分选、阳性细胞有限稀释、富集培养及单克隆细胞的鉴定和转录翻译水平验证等5个方面,进行实验研究。在编辑的乳腺肿瘤细胞MCF-7中,绿色荧光蛋白有效表达;乳腺癌细胞内绿色荧光蛋白的表达水平同FOXA2蛋白的表达水平正相关,且经肿瘤细胞上皮间质转化进程诱导因子EGF的诱导,绿色荧光蛋白和FOXA2表达水平同步降低。方法学上CRISPR/Cas9靶向FOXA2并利用细胞内同源性定向修复插入绿色荧光蛋白序列成功;利用报告基因蛋白表达水平示踪目的基因的开启、关闭及表达量高低结果准确、方法简单,效果明显。 相似文献
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本文比较了两种常用穿膜肽TAT和R9的体外穿膜效率、对细胞影响以及小鼠活体内不同器官的穿膜效率。非特异性穿膜肽TAT和R9分别为11个氨基酸和9个氨基酸的短肽,能够有效地穿过细胞膜进入细胞。本研究纯化制备出融合蛋白TAT-EGFP及R9-EGFP多肽,用相同浓度的活性TAT-EGFP和R9-EGFP处理肺癌细胞,观察比较二者的穿膜活性及效率;设置不同浓度梯度检测两种穿膜肽是否对细胞产生影响;通过小鼠腹腔注射TAT-EGFP和R9-EGFP活性肽段,研究二者在活体能够穿膜到达的靶位置,并比较分析二者穿膜的效果器官分布。结果显示制备获得的两种融合蛋白TAT-EGFP和R9-EGFP均能有效穿过实现穿膜功能,两种穿膜肽对乳腺癌细胞影响较小。活体试验证明两种穿膜肽在心、肝、脾、肺、肾器官均有分布,R9主要富集在小鼠的肾和肝脏中,TAT在6种被研究的器官都有富集,两种细胞穿膜肽都能透过血脑屏障到达脑部。相对来说,TAT在小鼠活体中的穿膜效果更好,荧光富集多,R9整体穿膜效果较弱。本研究分析比较了两种穿膜肽的细胞安全性浓度和活体的穿膜能力,为TAT和R9两种穿膜肽在后续试验中的合理有效的选择和使用,提供了基础数据和指导性依据。 相似文献
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