人源CLP的表达、纯化及生化特性研究

目的：为进一步研究CLP（coactosin-likeprotein）与5’-脂氧合酶、肌动蛋白的相互作用机制及功能,开展CLP克隆表达、分离纯化研究,以得到高纯度的CLP,并对其生物化学特性进行分析测定。方法：从人的胎肝cDNA文库中经PCR扩增得到CLP基因,克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中并获得高效表达,经过Glutathione Sepharose 4B亲和层析和Su-perdex 75分子筛纯化,得到高纯度的CLP;在此基础上进行SDS-PAGE、动态光散射和分析型超速离心等实验,并进一步分析实验结果。结果：CLP在溶液中主要以单体形式呈现;CLP的摩擦率为1．909,证实该蛋白质具有线性化趋势存在的可能性,且线性化程度较高。结论：实验结果揭示了CLP作为线性化蛋白质的可能性,为进一步搭建CLP和丝状肌动蛋白的作用模型奠定了一定的数据基础。     

重组猪溶素的生物学活性分析

摘要：【目的】 通过研究重组猪溶素（Recombinant Suilysin, rSLY）的生物学活性来分析猪溶素(Suilysin, SLY)在猪链球菌致病过程中的作用。【方法】 利用原核表达载体pET30a(+)表达SC22株猪链球菌的猪溶素基因（sly）,经Ni2+亲和柱、阴离子交换柱和凝胶过滤纯化获得rSLY制品。用微量法测定rSLY对人红细胞的溶血效价,用LDH法测定rSLY对人外周血白细胞、人胚胎肺源细胞、人胚胎肝细胞和人胚胎心肌细胞的毒性强度,并用水溶性胆固醇、人血清和特异性抗体阻断rSLY的溶血活性。用Luminex测定rSLY刺激小鼠后血清中前炎性细胞因子的浓度。【结果】我们测得重组猪溶素的溶血效价仅为0.125 nmol/L,但1 nmol/L rSLY对人外周血白细胞等的细胞毒性强度为20%～25%。水溶性胆固醇可阻断等摩尔浓度的rSLY,人血清样品（游离胆固醇的平均浓度为1～2 mmol/L）仅能阻断1 nmol/L rSLY的溶血作用。在人血清中添加15 mg/ml兔源抗猪溶素IgG可使10 nmol/L rSLY 的裂解强度从70%降到5%, 将猪溶素浓度提高到100 nmol/L时,红细胞裂解强度为60%。C57BL/6小鼠经腹腔注射rSLY后血清中白介素6、趋化因子KC持续上升,这与注射牛血清白蛋白的对照组小鼠血清中相应细胞因子浓度有显著性差异。【结论】 重组猪溶素不仅能直接损伤宿主细胞还能导致机体产生强烈的炎症反应,并进而损伤招募到炎症部位的免疫细胞;血清阻断rSLY溶血作用的能力很有限,特异性抗猪溶素抗体的保护作用表现为剂量依赖性。     

丛枝菌根真菌对滇重楼根茎中碳氮代谢的影响

目的:研究不同丛枝菌根真菌对滇重楼根茎内多糖类和总氨基酸含量的影响,为丛枝菌根真菌(AMF)的筛选提供科学依据.方法:采用蒽酮硫酸比色法测定滇重楼根茎内的多糖含量,色谱分析法测定滇重楼根茎内的总氨基酸含量,比较分析了不同AMF对滇重楼根茎内多糖和总氨基酸含量的影响.结果:滇重楼根茎内多糖和总氨基酸含量因接种不同AMF而...     

定点整合人Bcl-2基因的CHO/dhfr-细胞株的建立

构建重组载体质粒pMCEfrt—Bcl-2,利用FIp—In^TM定点重组系统,在CHO—dhfr^-细胞内定点整合人Bcl-2基因,通过Western印迹检测重组细胞Bcl-2蛋白的表达。通过流式细胞仪和DNA Ladder检测在高NH4C1条件下细胞的凋亡情况;用台盼蓝染色检测在无血清IMDM培养基中细胞的活细胞数目和活细胞比例。结果获得了稳定表达Bcl-2基因的细胞株CHO—Bcl-2,该细胞株能高水平表达Bcl-2蛋白。在无血清培养过程中,CHO—Bcl-2细胞比对照细胞保持高约15％的活细胞比例,细胞总数高25％。CHO-Bcl-2在高NH4^＋（50mmol／L）培养条件下具有较低的凋亡水平。建立了能够高表达Bcl-2基因并具有一定的抗凋亡能力的重组CHO／dhfr^-细胞株。     

Bcl-2蛋白的研究进展

Bcl-2基因属于Bcl-2基因家族,其表达的Bcl-2蛋白在细胞凋亡过程中通过抑制线粒体中细胞色素C的释放,可明显地抑制细胞凋亡。由于在大规模的细胞培养过程中,细胞的死亡以凋亡为主,所以可通过建立稳定过表达Bcl-2蛋白的重组细胞株,以抑制细胞的凋亡。同时,Bcl-2蛋白的变化不但可预见肿瘤的发生,而且通过药物降低Bcl-2的含量对于肿瘤的治疗也具有积极的意义。本文综述了Bcl-2蛋白的结构、功能、抗凋亡作用的机理,以及目前在生物制药和临床方面的应用和前景。     

人热休克蛋白转录因子1 DNA结合结构域的表达、纯化和晶体生长

目的:获得大量热休克转录因子1(HSF1)DNA结合结构域(DBD)蛋白,用于晶体生长的三维结构解析。方法:将DBD基因片段克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中并获得高效表达,经过Glutathione SepharoseTM 4B亲和层析、ResourceQ纯化后,蛋白纯度达到95%以上。结果:圆二色谱仪分析蛋白质的二级结构结果显示α螺旋占33%,β折叠占15%;采用悬滴气相扩散法得到了针状DBD晶体。结论:纯化的蛋白质与同源性达68%的Kluyveromyceslactis的DBD有相似的空间构象。获得的蛋白质晶体为进一步的三维结构解析奠定了基础。