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通过体细胞核移植技术制作了人胰岛素原转基因牛。在CMV启动子指导下以内部核糖体进入位点序列(IRES)连接的新霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因组成了双重标记基因的筛选系统,用于转基因细胞的富集以及细胞和植入前胚胎的筛选。转基因通过电穿孔的方法(900V/cm,5ms)转入体外培养的牛胎儿成纤维细胞,基因转染细胞在添加G418 (800μg/mL)的培养基中培养10天以富集转基因细胞。选择表达绿色荧光蛋白的转基因细胞作为核供体进行体细胞核移植,重构胚经体外培养至囊胚阶段,选择表达绿色荧光蛋白的囊胚进行胚胎移植。为比较基因转染以及供体细胞所处周期对转基因细胞核移植胚胎发育的影响,用作核移植供体的转基因细胞或非转基因细胞先饥饿培养2—4天(0.5 ?S) ,然后恢复培养(10?S) 10 h使细胞同步化于G1期,以正常培养的细胞作为对照进行核移植。结果表明,转基因细胞作为核供体得到的核移植胚胎的体外囊胚发育率低于以非转基因细胞为核供体的对照组(23.2% VS 35.2 %,P<0.05) ;转基因细胞周期同步化处理与否对其克隆胚囊胚发育率无显著影响(23.2% VS 18.9 %,P>0.05)。胚胎移植后2个月直肠检查发现7头受体牛(每头移植2—4枚胚胎)中有一头妊娠,并最终发育足月产下一头小牛。聚合酶链反应(PCR)检测和DNA测序分析表明其为转人胰岛素原基因的转基因克隆牛。 相似文献
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通过优化高产奶牛体细胞克隆胚胎体外生产技术条件,制备高质量的奶牛克隆胚胎,旨在提高奶牛体细胞核移植产业化应用效率。就受体卵母细胞去核方法、不同年龄供体牛细胞来源、血清饥饿与否以及不同气相组成培养等条件对奶牛体细胞克隆胚胎生产效率的影响进行了研究和探讨。结果表明,虽然荧光染色辅助去核和盲吸法的去核率、囊胚发育率分别为100%、24.83%和92.44%、28.26%,两者之间无显著差异(P>0.05),但盲吸法操作简单、效率高;不同年龄来源供体牛的细胞系构建的克隆胚胎的囊胚发育率分别为31.43%、25.68%,两者之间没有显著差异(P>0.05);经血清饥饿和未饥饿供体细胞重构的克隆胚胎囊胚发育率分别为24%、29.9%,两者之间没有显著差(P>0.05);富氧和低氧气相培养的克隆胚胎的囊胚发育率分别为28.26%、31.55%,两者之间差异不显著(P>0.05),低氧气相组成更有利于囊胚的发育。根据上述结果,奶牛体细胞核移植胚胎(克隆胚胎)的产业化生产条件为:供体细胞无需进行同期饥饿处理,直接注入到盲吸去核后的受体卵子透明带下构建克隆胚胎,融合后的克隆胚胎在密封的混合三气(5%CO2-5%O2-90%N2)的气相组成下进行体外培养,能保持稳定的囊胚发育率。 相似文献
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胚胎在发育过程中根据其多能性调控的特征可以分为两种状态,即原始态(naive)和激发态(primed).为了准确掌握这两种多能性状态之间相互转换、谱系分化、表观遗传修饰等调控机制,AUSTIN提出了一种假说,认为naive和primed状态之间存在另一种新的多能性中间状态,并将其命名为形成态(formative).最近... 相似文献
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本研究以自主研发的聚偏二氟乙烯膜(PVDF)细胞培养技术进行了梅花鹿(Cervus nippon)体细胞的航天培养及生物诱变,并分析了其细胞在航天诱变后的生长曲线和核型特性。采用耳缘皮肤组织块贴壁培养的方法进行体细胞的原代培养;胰蛋白酶消化的方法完成细胞的传代培养;依照程序降温的方法完成细胞的冷冻保存;每天计数24孔板每孔的活细胞数并利用Excel 97-2003绘制出细胞的生长曲线,采用IBM SPSS Statistics 23统计软件回归分析程序中的非线性回归分析子程序Logistic曲线模型分析细胞生长曲线的拟合度;以常规染色体标本制备技术,利用细胞遗传工作站(AI)软件对梅花鹿体细胞的染色体核型进行分析。实验结果表明,新开发的PVDF膜细胞培养技术可有效保持梅花鹿体细胞在太空飞行过程中的存活并成功回收、传代建系。通过细胞传代培养观察发现,该体细胞经航天诱变后保持正常的成纤维细胞特征,生长曲线呈"S"型,航天诱变组体细胞在培养4 d进入对数生长期,与对照组体细胞在培养2 d进入对数生长期相比其细胞增殖速度减慢。拟合生长曲线分析表明,航天诱变组细胞生长拟合度值与对照组相似,但细胞增殖拐点时间、拐点细胞量分析结果证明,航天诱变后的体细胞增殖速度减慢。核型分析显示,航天诱变梅花鹿体细胞染色体数保持2n=66,染色体形态正常,核型为66(XX),其中32对常染色体,1对性染色体。本研究建立了哺乳动物在航天运行条件下的细胞培养PVDF新技术,并分析了航天诱变对于梅花鹿细胞生物学特性变化的影响,为以后进行相关研究提供了基础信息和技术支持。 相似文献
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通过体细胞核移植技术制作了人胰岛素原转基因牛。在CMV启动子指导下以内部核糖体进入位点序列(IRES)连接的新霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因组成了双重标记基因的筛选系统,用于转基因细胞的富集以及细胞和植入前胚胎的筛选。转基因通过电穿孔的方法(900 V/cm, 5 ms)转入体外培养的牛胎儿成纤维细胞,基因转染细胞在添加G418(800 μg/mL) 的培养基中培养10天以富集转基因细胞。选择表达绿色荧光蛋白的转基因细胞作为核供体进行体细胞核移植,重构胚经体外培养至囊胚阶段,选择表达绿色荧光蛋白的囊胚进行胚胎移植。为比较基因转染以及供体细胞所处周期对转基因细胞核移植胚胎发育的影响,用作核移植供体的转基因细胞或非转基因细胞先饥饿培养2—4天(0.5% FBS),然后恢复培养(10% FBS)10?h使细胞同步化于G1期,以正常培养的细胞作为对照进行核移植。 结果表明,转基因细胞作为核供体得到的核移植胚胎的体外囊胚发育率低于以非转基因细胞为核供体的对照组(23.2% VS 35.2%, P<0.05);转基因细胞周期同步化处理与否对其克隆胚囊胚发育率无显著影响(23.2% VS 18.9%, P>0.05)。胚胎移植后2个月直肠检查发现7头受体牛(每头移植2—4枚胚胎)中有一头妊娠,并最终发育足月产下一头小牛。聚合酶链反应(PCR)检测和DNA测序分析表明其为转人胰岛素原基因的转基因克隆牛。 相似文献
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