温和气单孢菌YH311硫酸软骨素裂解酶的分离纯化与固定化

通过硫酸铵沉淀、QAESephadex-A50柱层析及Sephadex-G150凝胶过滤等纯化步骤,对源自温和气单孢菌YH311的ChSase进行了分离纯化。结果表明,ChSase经上述纯化步骤后被纯化了55倍,其最终纯度可达95%以上,比活为31.86u/mg。经SDSPAGE及IFE测定可知该酶的分子量约为80kD,等电点为4.3～4.8。将纯化后的ChSase用海藻酸钠或纤维素固定化后,ChSase的热稳定性及贮存稳定性均可得到大幅度的提高：固定化酶用80℃水浴处理120min或于4℃冰箱放置30d后仍可保留50%以上的相对活力;但固定化酶的收率较低,仅为18.56%和18.86%。     

硫酸软骨素酶产生菌的筛选及酶的分离纯化

利用平板快速筛选法,从鱼腹中筛选到一株产生硫酸软骨素酶的细菌YH311,通过生物特性和生化反应试验考察,初步鉴定为温和气单胞菌（Aeromonas sobria）。培养至36h时,该菌株产酶达到高峰期,培养液的酶活力达09U/mL。利用超声波破碎菌体细胞,分别测定培养液和菌体细胞的酶活力,发现培养液的酶活力要远远大于菌体细胞的酶活力,显示该酶为分泌型表达,属于胞外酶。发酵液经离心后,上清液用硫酸铵分级沉淀,再分别经过CMCellulose、QAEsephadex A50和Sephadex G150层析柱进行逐级分纯,并跟踪酶活,最后获得硫酸软骨素酶。SDSPAGE检测为单一条带,其分子量约为80kD。