HRCA技术在转基因植物检测中的应用

超分支滚环扩增技术（Hyperbranched rolling cycle amplification, HRCA）在近几年中逐渐引起人们的注意,并越来越多的用于基础研究和实际检测中。在本文中我们对该技术在转基因植物检测中的应用情况作了较全面的探索;根据4种转基因植物中常用的外源基因或DNA片段设计了4条锁式探针（Padlock probe）,利用质粒pKK2328中的一段序列作为锁式探针中的共同连接部分,并根据该共同的连接部分序列设计一对通用的HRCA引物;利用同位素标记的锁式探针对HRCA反应中的连接一步的特异性研究表明,只有当锁式探针和相应的检测靶DNA同时存在于连接体系中时,锁式探针才能被有效地进行连接,从线性分子变为环型分子,在没有相应靶DNA存在时锁式探针仅以线性形式存在;连接时间的研究表明,如果所检测的靶DNA是质粒或较短的DNA片段时,较短的连接时间（5～10min）就可以取得理想的最终检测效果,如果检测的靶DNA是复杂的植物基因组DNA时,连接时间需要较大程度的延长（30～60min）才能取得理想的最终检测结果;HRCA的反应时间研究表明,较长的反应时间可以明显增加最终产物的量;对Bst DNA聚合酶大片段酶用量的研究表明,在其它条件不变的情况下酶的用量可以在较大的范围内变化（0.5u～4u）而不影响最终检测结果;在上述研究的基础上,对转基因烟草进行实际检测,取得了与预期一致的理想结果。为了提高检测效率,仿效复合式PCR（Multiplex PCR,MPCR）的原理采用复合式HRCA（Multiplex HRCA, MHRCA）方法对转基因烟草进行检测,并利用反向点杂交进行结果分析,取得同预期完全一致的结果。我们的研究表明HRCA方法完全可以用于转基因植物的检测,而且其使用比MPCR技术更方便,效率更高。     

人睫状神经营养因子在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达和生物活性测定

The recombinant human ciliary neurotrophi factor(hCNTF)expressed in E.coli aggregatedas inclusion bodies and refolding procedure was necessary to obtine the active protein.To overcome the disadvantage,we cloned hcntf gene into yeast expression plasmid pPIC9K and collected the plasmid pPIC9K-hcntf.Plasmid pPIC9K-hcntf was transformed into yeast Pichia pastoris GS115,and screened on G418-SD plates.The transformants with high copies of hcntf gene were inoculated into BMMY media and induced with 0.5% methanol.The recombinant hCNTF was secreted into the media.The amount of hCNTF in the supernatant was about 10 mg/L when incubated in the conical flasks and reached up to 60 mg/L under fed-batch condition in 15 L fermentator.The recombinant hCNTF expressed in E.coli was renatured as the control.The neonatal rat dorsal root ganglion assay showed that proteins expressed in both systems have the activity of promoting the growth of neuron axons.The phenomenon can be observed with only 3 μg hCNTF expressed in yeast present,which indicates that hCNTF was successfully expressed in Pichia pastoris and has a relatively high activity.     

膜蛋白LASS2的表达研究

利用多种原核表达系统、真核体外翻译系统和细菌/杆状病毒(Bac to Bac)的昆虫表达系统对一个具有重要生理功能的人的膜蛋白LASS2(Homo sapienslongevity assurance homologue 2 of yeastLAG1)进行表达研究。在原核表达系统中仅能够表达其羧基端胞外区片段却不能表达完整的LASS2蛋白,并制备了该片段的抗体。完整的LASS2蛋白能够在两种真核表达系统中进行表达,SDS-PAGE分析结果表明,表达产物分子量为约28kD的LASS蛋白, Western印迹分析也证实了这一结果, 并利用Ni-NTA树脂亲和层析将该蛋白纯化,纯度达到90%以上。