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本文报道利用T_4 RNA连接酶酶促合成酵母丙氨酸转移核糖核酸3′端(36~45)Cp~(m~1)Ip-ψpGpGpGpApGpApG十核苷九磷酸片段的工作。合成制备时,我们采用将Cp~(m~1)IpψpG、GpG、ApGpApGp三片段从5′向3′延伸的合成路线。在合成路线的探索中我们发现了一些新现象:1.在T_4 RNA连接酶催化反应中Cp~(m~1)Ipψ作为受体有局限性。2.GpG等二核苷一磷酸可以与pCp等供体分子连接。3.60℃预温育对GpG片段的标记和六核苷酸、十核苷酸连接反应提高产率有明显的作用。 相似文献
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金黄色葡萄球菌核酸酶(StaphlococcalNuclease,SNase)与其类似物(SNaseR)的平衡态盐酸胍变性与复性曲线及比活力值均无明显差别。两者变性与复性的构象变化是可逆的,但活力恢复滞后于失活。低浓度盐酸胍对SNaseR有20%左右的激活,而低浓度(0.125mol/L)的NaCl可使SNaseR的活力提高近一倍。SNaseR盐酸胍变性的失活先于构象变化。比较加入底物竞争抑制剂脱氧胸腺嘧啶核苷3'-5'-二磷酸(pdTp)后得到的(SNaseR+pdTp+Ca2+)三元络合物平衡态盐酸胍变性的Trp与Tyr内源荧光的变化,观测到该酶的活性部位先于整体构象发生变化,结果导致pdTp解离常数Kd增大. 相似文献
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金黄色葡萄球菌核酸酶(StaphlococcalNuclease,SNase)与其类似物(SNaseR)的平衡态盐酸胍变性与复性曲线及比活力值均无明显差别。两者变性与复性的构象变化是可逆的,但活力恢复滞后于失活。低浓度盐酸胍对SNaseR有20%左右的激活,而低浓度(0.125mol/L)的NaCl可使SNaseR的活力提高近一倍。SNaseR盐酸胍变性的失活先于构象变化。比较加入底物竞争抑制剂脱氧胸腺嘧啶核苷3'-5'-二磷酸(pdTp)后得到的(SNaseR+pdTp+Ca2+)三元络合物平衡态盐酸胍变性的Trp与Tyr内源荧光的变化,观测到该酶的活性部位先于整体构象发生变化,结果导致pdTp解离常数Kd增大. 相似文献
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金黄色葡萄球菌核酸酶R(SNase R)是金黄色葡萄球菌核酸酶(SNase A)的一种类似物,具有与SNaseA相同的酶活性,与SNase A唯一不同之处是在N端多出6个氨基酸残基。为了得到完整的SNase基因并使其在E.Coli中表达,我们利用单链U模板—单引物突变法,将为6个额外氨基酸残基编码的18个氨基酸残基删除,其突变率可达90%。进而,完整的SNase A基因被重组入表达载体pBV221。细菌表达产物的PAGE分析结果指出,SNase A在E.coli中得到高效表达。与此同时,我们利用两个不同的引物在单链U模板上同时介导两种不同类型的突变(片段缺失、碱基取代)其突变率可达83%以上,这为进行多种类型的高效突变提供一个有用的方法。本文也对影响突变率的某些实验因素进行了讨论。 相似文献
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在pFOG405重组质粒中的大肠杆菌碱性磷酸酶基因(PhoA)的启动子及信号肽区的核苷酸顺序被测定并同Kikuchi等人在pYK190重组质粒中所报道的顺序进行了比较。结果指出,包含有PhoA基因启动子及信号肽的PvuⅡ-HpaⅠ片段对于调控外源基因的表达是足够的;启动子5’-端的二元对称结构(26bp)的缺失并不影响外源基因的表达水平。由于pYK190及pFOG405中PhoA基因启动子的上游区核苷酸顺序的不同源性,说明此上游区顺序与PhoA启动子调控下的外源基因表达无关。这一分析为我们利用PvuⅡ-HpaⅡ片段组建高效分泌表达载体及研究基因表达调控提供了有用信息。 相似文献
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将携带金黄色葡萄球菌核酸酶(SNase)基因的质粒pFOG405转化到大肠杆菌SE6004中,获得分泌表达的SNase,在该酶的测活体系中,观察到激活剂Ca~(2+)与底物DNA微弱结合,引起底物DNA的UV光谱在260nm附近明显下降。在Ca~(2+)浓度为10mM时,底物DNA紫外区CD光谱在270—280nm和210—230nm处〔θ〕值减少,〔θ〕值为零的点从260nm移至257nm。这一结果表明,Ca~(2+)与底物DNA在缺少SNase的情况下仍能结合,引起DNA分子构象变化。 相似文献
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将携带金黄色葡萄球菌核酸酶(SNase)基因的质粒pFOG405转化到大肠杆菌SE6004中,获得分泌表达的SNase,在该酶的测活体系中,观察到激活剂Ca~(2+)与底物DNA微弱结合,引起底物DNA的UV光谱在260nm附近明显下降。在Ca~(2+)浓度为10mM时,底物DNA紫外区CD光谱在270—280nm和210—230nm处〔θ〕值减少,〔θ〕值为零的点从260nm移至257nm。这一结果表明,Ca~(2+)与底物DNA在缺少SNase的情况下仍能结合,引起DNA分子构象变化。 相似文献
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