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目的比较研究Up and Down法与寇氏法测定破伤风毒素LD50值。方法 NIH小鼠皮下注射破伤风毒素,分别使用寇氏法和Up and Down法计算LD50值。结果同一破伤风毒素经寇氏法计算得LD50值为4.97ng/Kg体重,Up and Down法计算LD50值为4.93 ng/Kg体重,95%置信区间为(4.71~5.13)ng/Kg体重。结论应用Up and Down法可测出与寇氏法相同结果的LD50值,且动物使用数量仅用8只。 相似文献
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目的:利用CRISPR/Cas9技术建立人Vasorin(VASN)基因稳定敲除的HepG2细胞株,并研究VASN蛋白对细胞增殖和迁移等生物学功能的影响。方法:根据人VASN序列设计向导RNA,将其克隆至表达载体pCas-Guide,获得质粒pCas-gRNA;PCR扩增VASN编码基因左、右同源臂及潮霉素B抗性基因,通过重叠PCR将三者拼接为一条片段,并克隆至载体pBackZero-T,获得质粒pBackZero-T-VASN;上述2种重组质粒共转染HepG2细胞,经潮霉素B筛选,通过基因组PCR、RT-q PCR和Western印迹实验检测VASN基因是否被敲除。利用CCK-8法和Transwell法检测VASN稳定敲除细胞株的增殖和迁移能力。结果:向导RNA表达质粒pCas-gRNA和DNA供体质粒pBackZero-T-VASN构建成功;基因组PCR结果显示,潮霉素B基因正确重组至VASN基因中;RT-PCR显示VASN m RNA水平显著降低,Western免疫印迹结果显示VASN蛋白表达水平显著降低;VASN稳定敲除细胞株的增殖和迁移能力比野生型细胞明显减弱。结论:构建了pCas-gRNA和pBackZero-T-VASN质粒,获得了VASN缺失的细胞株,验证了VASN蛋白参与细胞的增殖和迁移过程,为深度探讨VASN的生物学功能及其分子机制奠定了基础。 相似文献
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该研究基于已公布的大豆基因组序列信息,对大豆KUP/HAK/KT钾转运体基因家族进行了全基因组鉴定,并对该家族成员的基因特征、蛋白结构、染色体定位、基因复制和表达模式等进行了全面分析,为进一步了解该家族基因的功能及培育钾高效大豆品种提供理论支撑。结果表明:(1)在大豆基因组中共鉴定30个KUP/HAK/KT基因(简写为GmHAK01~GmHAK30),这些基因分布在大豆的15条染色体上,串联复制和片段复制可能导致了GmHAKs基因在大豆基因组中的扩增。(2)大豆GmHAKs蛋白间序列一致性很高,均具有12~14个跨膜区,且都定位于质膜上。(3)进化分析表明大豆GmHAKs可聚为4个进化簇ClusterⅠ~Ⅳ,其中ClusterⅡ的成员数目最多(16个),ClusterⅣ的成员数目最少(1个)。(4)所有GmHAKs基因均包含内含子和外显子,其内含子数目在7~9个之间,且同一亚家族的GmHAKs基因大部分具有相似的内含子-外显子分布模式。(5)表达模式分析表明,大豆GmHAKs的表达大致可分为两类:一类是一些组织特异性表达的基因,包括了ClusterⅠ和ClusterⅣ的全部成员,ClusterⅡ的部分成员,他们在根(GmHAK30和GmHAK04)、花(GmHAK03和GmHAK15)、荚(GmHAK10)或种子(GmHAK25)中表达量很高;另外一类是一些非组织特异性表达的基因,包括了ClusterⅢ的全部成员和ClusterⅡ的部分成员,这些基因(GmHAK05、GmHAK17和GmHAK28等)在所有被检测的组织中均有较高的表达;KUP/HAK/KT家族基因表达模式在不同进化簇的差异化结果表明,其在进化过程可能受到了选择的作用。以上研究结果为今后研究KUP/HAK/KT家族基因功能及定向改良大豆的钾吸收物性提供了重要的基因信息,也为大豆钾高效品种的选育提供了理论基础。 相似文献
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利用噬菌体展示的线性12肽库从马抗SARS-CoV IgG筛选SARS-CoV的抗原表位.经生物淘洗富集的噬菌体克隆被测序.获得两个共有序列DXXDP和TXTLL.它们分别与SARS-CoV N蛋白341-345和392-396位氨基酸序列高度同源.含共有序列的克隆在ELISA竞争抑制试验中与SARS-CoV N蛋白竞争结合马抗SARS-CoVIgG.将两个共有序列肽通过基因重组技术成功展示到大肠杆菌鞭毛,获得重组菌F1和F2.用重组菌F1和F2免疫接种试验Balb/c小鼠产生的血清均能与SARS-CoVN蛋白特异结合.说明DXXDP和TXTLL是SARS-CoVN蛋白的两个连续抗原表位. 相似文献
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目的:利用CRISPR/Cas9技术构建人Ku70基因稳定敲除的HeLa细胞株,并检测其生物学功能。方法:设计并构建向导RNA载体p Cas-g RNA和同源重组供体DNA载体p Back Zero-T-Ku70,2种重组质粒共转染HeLa细胞,加入潮霉素B进行抗性筛选,通过基因组PCR和Western印迹检验Ku70基因是否被敲除;进而,选择Ku70稳定敲除的细胞株,分别采用CCK-8和Transwell实验检测细胞增殖和迁移能力;此外,提取细胞总RNA,反转录成c DNA后用荧光定量PCR仪检测5种miRNA(hsa-miR-649、hsa-miR-544a、hsa-miR-562、hsa-miR-548a、hsa-miR-492)的表达水平。结果:g RNA表达质粒p Cas-g RNA和DNA供体质粒p Back Zero-T-Ku70构建成功;2种重组质粒共转染HeLa细胞,基因组PCR扩增出特异的基因重组DNA片段,Western印迹结果显示Ku70蛋白已基本无表达。细胞增殖和迁移实验显示敲除Ku70基因的HeLa细胞增殖和迁移能力均有所减弱。q RT-PCR结果显示,敲除Ku70基因致hsa-miR-649、hsa-miR-544a和hsa-miR-562水平有所升高,而hsa-miR-548a和hsa-miR-492水平未有明显变化。结论:获得Ku70基因稳定敲除的细胞株;Ku70蛋白可能参与了HeLa细胞增殖和迁移过程;其还可能调节部分miRNA的表达。 相似文献
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砂质潮间带自由生活海洋线虫对缺氧的响应——微型受控生态系研究 总被引:4,自引:0,他引:4
以青岛砂质潮间带自由生活海洋线虫为研究对象,建立微型受控生态系,研究缺氧对海洋线虫群落结构和垂直分布的影响,以及环境复氧后海洋线虫群落的恢复能力。研究结果显示,海洋线虫是耐低氧的小型底栖动物类群,可通过垂直迁移来耐受缺氧造成的不利条件。但是,海洋线虫通过主动迁出而耐受缺氧条件的特性具有种的区别。研究中Pseudosteineria sp1、Rhynchonema sp1等海洋线虫通过向有氧环境的主动迁移耐受缺氧条件;Thalassironus sp1却可通过自身耐受机制抵御缺氧条件,在缺氧生境中仍能保持较高的丰度。此外,研究结果显示,当表层海洋线虫暴露于缺氧环境时,其总丰度显著降低,种类组成发生改变。Pseudosteineria sp1对缺氧环境较为敏感,可暂时性地离开沉积物进入水层;而沉积物溶解氧恢复正常后,该种可以重新回到沉积物中。Daptonema sp1成熟个体及其幼龄个体对缺氧均具有较高的耐受性,是缺氧群落的绝对优势种。D.sp3则表现出对缺氧环境较高的敏感性。环境恢复正常,线虫群落丰度及多样性增加,Neochromadora sp1和Spilophorella sp1等具有机会种的特点,首先表现出丰度和繁殖能力的增加。但是线虫群落种类组成在受测时间内并未能完全恢复,群落结构的恢复需要更长的时间。 相似文献
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目的:黄瓜花叶病毒 (Cucumber mosaic virus,CMV) 编码的2b蛋白具有RNA沉默抑制子的功能,其C末端氨基酸序列非常保守。为了明确2b蛋白C末端保守序列在RNA沉默抑制中的作用,构建了CMV Q株系野生型2b及其C末端缺失突变体2bdelC的植物瞬时表达载体。通过农杆菌共渗滤法对野生型2b及其C末端突变体的沉默抑制子活性进行了分析。结果与结论:烟草接种叶片中野生型2b及其C末端突变体的Western blot检测表明,野生型2b蛋白与其C末端突变体在植物中积累水平变化不大,说明2b蛋白C末端氨基酸残基在维持2b蛋白在植物细胞中的稳定性方面无作用。在整株、细胞和分子水平上分别比较了野生型2b及其突变体2bdelC对共表达GFP的表达量影响,结果表明在所有的测定结果中二者均无明显地差异,说明2b蛋白C末端94-111位氨基酸在抑制局部RNA沉默上无生物学活性,讨论推测C末端应不存在与小RNA结合的结构域。 相似文献
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旨在探讨原因不明子宫内膜薄雌激素受体α(estrogen receptor alpha,ERα)基因多态性及其与表达的关系。选择120名原因不明子宫内膜薄患者为试验组,120名子宫内膜正常人群作为对照组。应用分子生物学的方法分析ERα基因PvuⅡ,XbaⅠ限制性片段长度多态性。通过逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)和Western印迹法分析ERα表达。结果显示,P基因型频率试验组为47.1%,对照组为30.0%,OR值:2.076。试验组X基因型频率为20.8%,对照组为30.4%,OR值:0.602。Pvu II和Xba I限制性片段长度多态性在两组中均呈多态性分布。试验组ERα的mRNA和蛋白质表达均比对照组降低(P0.05)。由此得出,ERα基因多态性与原因不明子宫内膜薄有关,P等位基因可能是其危险因素,X等位基因可能是其保护因素。ERα在子宫内膜中原因不明子宫内膜薄中的表达低于子宫内膜厚度正常子宫内膜。 相似文献
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目的:在金黄色葡萄球菌中分别构建RNaseHⅠ、RNaseHⅡ和RNaseHⅢ的突变菌株,并研究它们在金黄色葡萄球菌中的生物学功能。方法:利用同源重组的方法在金黄色葡萄球菌中分别构建RNaseHⅠ、RNaseHⅡ和RNaseHⅢ的插入突变菌株,检测突变株生长速度、溶血活性及外分泌蛋白表达水平与野生型的差异,进一步通过流式细胞术检测突变株外分泌蛋白细胞毒性的改变,同时在体外检测突变株在全血中的存活能力。结果:构建了金黄色葡萄球菌RNaseHⅠ、RNaseHⅡ和RNaseHⅢ的插入突变菌株;表型检测结果显示,与野生型菌株相比,3种突变株的生长速度减慢,溶血素和外分泌蛋白明显减少;流式细胞术检测结果显示3种突变株毒性比野生型菌株减弱;全血杀伤实验结果显示3种突变株在全血中的存活率低于野生型菌株。结论:RNaseHⅠ、RNaseHⅡ和RNaseHⅢ在金黄色葡萄球菌生长繁殖、毒素产生和侵袭机体的过程中有重要作用,它们可能与金黄色葡萄球菌的致病性相关。 相似文献