用荧光染料直接标记凝胶照相底片

用荧光染料直接标记凝胶照相底片核酸样品经凝胶电泳、ＥＢ染色后可在紫外灯下照相保存。为在照片上记下实验时间、内容,可用吖啶橙作“墨水”来做。将电泳后的凝胶放在紫外透射反射仪上,用３Ｍ厚的滤纸小心吸干凝胶表面残留的缓冲液,盖上一层塑料薄膜。取一块大小适合...     

抗DAZAP2抗体的制备及在多发性骨髓瘤研究中的应用

为了进一步从蛋白水平上检测DAZAP2(deleted in azoospermia associated protein 2)在多发性骨髓瘤患者中的表达及研究DAZAP2的功能,以正常人的骨髓单个核细胞的总RNA为模板,RT-PCR扩增DAZAP2完整编码序列,构建原核表达重组质粒pQE30-DAZAP2,转化大肠杆菌JM109后,加IPTG诱导表达4h时,表达蛋白显著增加,Ni-NTA层析柱纯化蛋白。以该纯化蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗DAZAP2抗体,ELISA检测抗体的效价在1：6400以上,Western blot检测抗体的特异性较好．用该抗体检测出DAZAP2雀6例正常人及4例多发性骨髓瘤患者中有表达,其他7例患者中没有表达,与RT-PCR结果一致,该抗体具有一定的临床应用前景,并能进一步用于功能研究．     

DNA足纹步移作图法

一种以PCR介导的、可对任意长度靶DNA片段上的核蛋白结合位点进行DNA足纹作图分析的新方法.原理是：采用被随机降解靶DNA分子作为模板,用标记的跨越整个模板的足够多条特异性引物进行单链扩增.首先,利用某种化学试剂或酶如DNaseⅠ对已与蛋白质结合或未结合的双链靶DNA进行随机降解,在一定条件下使每一个DNA分子恰好只有一个位点被切割.然后,这些被随机降解DNA分子即可作为模板,用同位素标记的跨越整个模板的足够多条特异性引物（正向或反向）进行单链扩增.最后,扩增的单链产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影形成DNA片段梯队,而被蛋白质保护的位点则在DNA片段梯队中形成位置缺口,从而确定DNA与蛋白质相结合的精确位点.该方法被应用对人干细胞因子基因5′旁侧－1190～－273区域的DNA足纹部分作图.     

受强力霉素调节的自杀基因表达载体系统的构建和在乳腺癌细胞株(MCF-7)的表达

自杀基因治疗是恶性肿瘤基因治疗中最常用的途径之一,以递转录病毒载体-pRevTRE为基础进行载体构建,首先使用PCR技术对单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSVtk)进行扩增,将HSVtk基因插入到pRe-vTRE,形成重组载体pRevTRE/HSVtk,用磷酸钙共沉淀法,经过两轮转染,分别将pRevTRE/HSVtk和pRevTet-On质粒导入乳腺癌细胞株（MCF-7）经过潮霉素B（HygromycinB)和G418筛选,建立了一株稳定的受四环素衍生物-强力霉素（Doxycycline,Dox)调控,表达HSVtk基因产物的人乳腺癌细胞株MCF/TRE/tk/Tet-On,HSVtk基因表达产物可以将无毒性的药物前体Ganciclovir(GCV)转变成一种有毒的代谢产物,从而杀死乳腺癌细胞株（MCF-7）,达到基因治疗的目的。     

定量RT-PCR中人干细胞因子的RNA-CRS的构建

一种适用于定量RT-PCR、用ExonucleaseⅢ部分酶切剔除技术,构建人干细胞因子(hSCF)基因的RNA竞争性参考标准(RNA-CRS)的新方法：用RT-PCR技术,从HepG2细胞中扩增出全长人hSCF cDNA,并克隆入质粒pGEM-T获重组的pGEMSCF载体,经ExonucleaseⅢ和S1核酸酶适当处理,以导致hSCF cDNA中一小片段缺失,由此获得重组pGEMSCF模拟体(mimic),经体外转录得到hSCF RNA-CRS.测序表明：该RNA-CRS与hSCF mRNA比较,缺失了从第499位至608位共110个核苷酸,但二者RT-PCR反应可用同一对扩增引物,反应动力学极为相似.这种hSCF RNA-CRS可作为一种较理想的竞争性参考标准,适用于定量RT-PCR中,以对重组hSCF在真核细胞中的表达水平进行准确的定量分析.此方法亦可推广应用于其他真核基因的表达水平及/或调控的检测和研究.     

PCR－SSCP技术在基因点突变检测中的几种策略

ＰＣＲ－ＳＳＣＰ技术在基因点突变检测中的几种策略王吉伟,罗赛群（湖南医科大学分子生物学研究中心,长沙４１００７８）关键词ＰＣＲ－ＳＳＣＰ,点突变检测基因点突变的检测对于分子种群生物学的研究、遗传性疾病预测及分子水平的临床诊断等颇具实用价值。在众多的测...     

猪的全基因组水平SNP研究现状

SNP（single nucleotide polymorphism,单核苷酸多态）在猪基因组中的分布极其广泛,平均分布间隔为300～400 bp,相关数据库收录已达55万条。猪基因组测序已取得实质性进展,大规模搜索发现基因组及EST（expressed sequence tag）序列中的SNP已展开,应用于猪全基因组水平的SNP芯片已建立。在此基础上,基于猪SNP标记的遗传图谱绘制、QTL（quantitative trait loci）定位、遗传多样性检测及全基因组关联分析等也都相继出现。     

多发性骨髓瘤细胞株ARH-77L1逆转录酶基因的克隆及体外表达研究

通过菌落原位分子杂交,从多发性骨髓瘤细胞株ARH-77 cDNA文库获得L1逆转录酶基因5’端序列．随后使用3’RACE技术,获得L1逆转录酶基因3’端序列及poly(A)尾．生物信息学分析表明：该L1逆转录酶DNA序列有一长552bp开放性阅读框,编码184个氨基酸残基的多肽链,其相对分子质量约为21kDa．同时将编码L1逆转录酶保守区的开放性阅读框DNA片段与原核表达载体pQE30连接,得到重组原核表达质粒,利用大肠杆菌表达并获得L1逆转录酶融合蛋白．     

人SCF基因5′旁侧-1190～- 853 AT富集区功能研究

 已有的报告基因和EMSA实验研究表明 ,人干细胞生长因子 (SCF)基因 5′旁侧AT富集区- 1 1 90～ - 853在HeLa和MCF 7细胞中均能增强下游基因转录 ,可能为一个核基质结合区(MAR) ,对人SCF基因的转录发挥调控作用 .为进一步研究该AT富集区的功能 ,将人SCF基因 5′旁侧 - 1 1 90～ - 853AT富集区分别克隆入SV40或CMV启动子前后紧接着CAT报告基因 ,瞬时转染Jurkat,HepG2和 3T3细胞 ,检测CAT报告基因的瞬时表达活性 .结果表明 :人SCF基因 5′旁侧- 1 1 90～ - 853AT富集区在Jurkat和HepG2细胞中 ,对分别由SV40和CMV启动子引导的CAT基因表达均有抑制作用 ;但在 3T3细胞中对SV40启动子的转录活性表现出增强作用 ,对CMV启动子的转录活性无明显影响 .这些结果提示 ,人SCF基因 5′旁侧 - 1 1 90～ - 853AT富集区转录调控具有组织细胞特异性 ,在不同的细胞中可能发挥转录增强或抑制作用     

Tet-On调控HSVtk表达的重组腺相关病毒载体的构建和感染活性的检测

构建含有Tet基因调节系统及自杀基因HSVtk的重组腺相关病毒载体pAAV TRE HSVtk Tet_On ,并使用PCR技术和限制性内切酶消化进行鉴定。用构建好的重组质粒分别与辅助质粒pAAV_RC、pHelper以磷酸钙共沉淀法转染HEK2 93细胞,进行病毒包装后得到了AAV TRE HSVtk Tet_On重组腺相关病毒,以氯化铯密度梯度离心对包装好的病毒进行纯化。用纯化后的重组腺相关病毒感染乳腺癌细胞株MCF_7后,斑点杂交检测结果显示,HSVtk基因整合进入MCF_7细胞基因组中。有感染活性的重组腺相关病毒能将目的基因转移到宿主细胞中,在Dox诱导下,GCV对AAV感染的MCF_7细胞具有明显的杀伤作用。