变铅青链霉菌体内游离胞嘧啶的发现及检测

【背景】胞嘧啶(cytosine,C)是核酸分子4种基本碱基之一。胞嘧啶首先是以胞苷三磷酸(cytosine triphosphate,CTP)的形式合成,在核酸基础代谢中没有形成游离胞嘧啶的特定途径。杀稻瘟菌素(blasticidin S,BS)和谷氏菌素生物合成途径均以游离的胞嘧啶为前体,前者的生物合成基因簇中包含一个能水解胞苷单磷酸(cytidine monophosphate,CMP)生成胞嘧啶的水解酶BlsM,后者的生物合成基因簇及其产生菌的基因组中均没有这个水解酶对应的同源蛋白。【目的】检测不同细菌中是否普遍存在游离的胞嘧啶,探究是否存在能产生游离胞嘧啶的同工酶或新途径。【方法】在BS异源表达菌株Streptomyces lividans WJ2中敲除blsM,高效液相色谱(HPLC)检测突变株和WJ2发酵产物;液相色谱-质谱联用(LC-MS)检测10个经过分级纯化的微生物细胞裂解液上清中是否存在游离的胞嘧啶。【结果】突变株WJ2?blsM菌株仍能合成杀稻瘟菌素,但各组分产量与WJ2菌株相比均明显降低;除了变铅青链霉菌,在10株被检测的菌株中,金黄色葡萄球菌(Staphyl...     

一种适用于链霉菌异源合成基因簇同框缺失的高效方法

【背景】对抗生素生物合成途径的阐明有助于提高目标化合物的产量并开发具有更高活性的新化合物。基因的同框缺失是天然产物生物合成研究的常规手段,通过分析突变菌株积累的中间产物,可以帮助推导天然产物的合成途径及相关基因的功能。天然产物生物合成基因簇的大小一般在20 kb以上,对每个基因进行同框缺失耗时耗力,因此,优化链霉菌来源的基因同框缺失的方法有重要的意义。【目的】基于PCR-targeting重新设计了一套在链霉菌柯斯文库质粒上进行基因同框缺失的方法,实现链霉菌基因在大肠杆菌中快速、高效的基因同框缺失的技术体系。【方法】使用氨苄青霉素抗性基因bla作为PCR-targeting DNA片段的筛选标记,同时使用体外的Pac I酶切和酶连系统代替体内的Flp/FRT系统来介导同框缺失的构建。【结果】利用这种方法,在6 d内完成了米多霉素生物合成基因簇中14个基因的同框缺失。【结论】此方法与传统的PCR-targeting方法相比,构建同框缺失载体的效率明显提高;Pac I识别序列在链霉菌基因组上的稀有性使得此方法在构建抗生素生物合成基因簇必需基因的同框缺失载体上具有普适性。