Ⅱ型登革病毒NS1蛋白的表达及其免疫血清的制备

目的原核表达、纯化II型登革病毒NS1A蛋白(NS1蛋白1～180氨基酸即DENV2 NS1A),将其免疫动物制备免疫血清并鉴定。方法构建重组融合质粒p ET22b-p64K-L-DENV2 NS1A,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG低温诱导表达。表达的融合蛋白经Hitrap Talon crude柱亲和层析纯化后,免疫雌性日本长耳兔获得抗DENV2 NS1A兔抗血清,用Western blot和免疫荧光检测免疫血清对重组麻疹病毒MV_(S191)-DENV2 NS1 6Xhis的识别和结合特性。结果重组融合质粒p ET22b-p64K-L-DENV2 NS1A经双酶切和测序证明构建正确。表达的重组融合蛋白相对分子质量为100 000,纯化后蛋白纯度在85%以上,免疫获得的抗DENV2 NS1A兔抗血清可识别重组病毒MV_(S191)-DENV2 NS1 6XHis表达的DENV2 NS1蛋白。结论原核表达并纯化了DENV2 NS1A蛋白,建立了基于NS1蛋白的重组病毒MV_(S191)-DENV2 NS1 6XHis的Western blot和免疫荧光检测方法,为登革热疫苗研制中重组病毒MV_(S191)-DENV2 NS1 6XHis的质检奠定了基础。     

基于mRNA 5'端TIR区二级结构优化提高重组sTNFαRI在大肠杆菌中的表达水平

目的:通过优化PET11b-s TNFαRI 5'mRNA翻译起始区(TIR)二级结构从而提高可溶性肿瘤坏死因子I型受体(sTNFαRI)在大肠杆菌[E.coli BL21(DE3)]中的表达水平。方法:通过对PET11b-s TNFαRI mRNA 5'端TIR区二级结构的自由能及核苷酸位置熵分析,设计相应的引物对mRNA 5'翻译起始区(TIR)相应密码子进行突变,从而使核糖体结合位点(RBS)及起始密码子(AUG)暴露于发夹结构之外,此外将p ET11b核糖体结合位点由GAAGGAGA突变为GAAGAA,以利于翻译复合体的组装以及翻译起始。通过基因克隆的方法将5'端TIR区优化后的序列与s TNFαRI序列一起克隆到p ET11b载体中,并转化大肠杆菌BL21(DE3),阳性转化子经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测。结果:通过对PET11b-s TNFαRI 5'TIR mRNA二级结构优化,经SDS-PAGE和Western blot分析表明重组s TNFαRI的表达水平较优化前提高50%~60%。结论:通过对重组载体翻译起始区(TIR)mRNA序列的二级结构优化可以有效提高目的蛋白的表达水平,对进一步工业化生产具有重要的应用价值。