蛋白激酶C抑制剂Staurosporine对A类清道夫受体胞浆域结构去除后功能的影响

A类清道夫受体（scavenger receptor,SR-A）是一种主要位于巨噬细胞膜表面的同源三聚体糖蛋白,能够结合和摄取多种配基并介导内移.在清道夫受体胞浆域有几个潜在的磷酸化位点,有关这些磷酸化位点与受体功能之间的确切关系目前尚所知甚少.为深入探讨A类清道夫受体胞浆域与磷酸化之间的关系,以及受体胞浆域磷酸化对受体功能的影响,实验以含有SR-A cDNA质粒为模板,采用PCR方法扩增不含胞浆域序列的清道夫受体,同时扩增全长清道夫受体作为对照.PCR产物经纯化酶切后,进一步亚克隆到PcDNA3.1/HisB中,测序结果表明,重组产物能够编码正确的氨基酸序列.重组产物经脂质体Lipofectamine(LF2000)介导转化入CHO细胞中,在含G418选择性培养液中培养筛选14天后,分离阳性克隆, 继续培养.采用流式细胞计数仪（FACS）鉴定转化筛选后细胞能否表达具有功能的清道夫受体.结果发现,转化的CHO细胞可以稳定表达SR-A的蛋白质,但受体胞浆域去除后,摄取配基的能力明显弱于全长组（1∶1.337）.用荧光DiI标记乙酰化低密度脂蛋白(DiI-AcLDL),37℃孵育转化细胞5 h后,激光共聚焦显微镜下观察到：全长受体转化组细胞荧光散在分布于细胞膜和细胞器,而去除胞浆域组荧光只局限于细胞膜,说明SR-A胞浆域可能起着介导受体内移的作用.进一步比较蛋白激酶C抑制剂星形孢菌素(staurosporine,STA）对两组细胞受体功能的影响,发现经STA处理后,全长组受体与配基的结合及摄取明显增高,而胞浆域去除后受体不受STA的调控.从而证明磷酸化药物可能是通过改变SR-A胞浆域磷酸化水平而发挥作用,受体胞浆域磷酸化可能决定着受体的内移,并参与调节受体的活性.     

乳腺癌细胞中p27kip1分子相互作用蛋白质谱的改变

p27kipl是细胞周期重要的负性调控因子,在乳腺癌等多种肿瘤发生发展过程中发挥重要作用.乳腺癌细胞中p27kipl蛋白通常是低丰度表达和错位分布,导致这种分布和表达改变的确切机制并不明确.已有研究表明,p27kipl磷酸化是重要的调节途径之一,细胞内外信号分子通过多种途径调节p27kipl的分布和表达.为了进一步阐明肿瘤细胞内调节p27kipl功能的分子机制,必须首先明确p27kipl在肿瘤细胞与正常细胞中相互作用蛋白质谱的差异.包括细胞周期素、周期素依赖性激酶、CRM1、jab1、Skp2等在内的多种分子可以与p27kipl发生相互作用.在乳腺癌细胞中还有儿种特异的作用分子.在不同细胞周期和不同细胞内分布状态下,p27kipl蛋白有不同的相互作用蛋白质谱.因此,我们推断在乳腺癌细胞内p27kipl分子相互作用蛋白质谱的差异可能是导致其低表达和错位分布的主要机制.