中华鳖血清中抗体含量的研究

脊椎动物抗体的类型较多 ,如在哺乳类中可分为ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ及ＩｇＤ。在血清中的含量也各异 ,如在人血清中ＩｇＧ为 12 5ｍｇ/ｍＬ ,ＩｇＭ为 1 2 5ｍｇ/ｍＬ (杨廷彬和尹学念 ,1994)。低等脊椎动物 (如硬骨鱼 )免疫系统欠发达 ,一般认为其血清中只有 1种抗体即ＩｇＭ ,如大西洋鳕(Ｇａｄｕｓｍｏｒｈｕａ)的抗体浓度达 5 6 2ｍｇ/ｍＬ (Ｌｅｓｌｉｅ＆Ｃｌｅｍ ,1972 )。中华鳖 (Ｔｒｉｏｎｙｘｓｉｎｅｎｓｉｓ)血清中也只含有 1种高分子量的抗体 (简纪常等 ,1998) ,但其血清浓度尚不清楚 ,这有碍于对中华鳖体液免疫…     

尼罗罗非鱼NCCRP-1基因的原核表达及条件优化

非特异性细胞毒性细胞受体蛋白(non-specific cytotoxic cell receptor protein 1,NCCRP-1)是一种在鱼类非特异性细胞毒性细胞(non-specific cytotoxic cell,NCC)活化过程起到关键作用的受体蛋白,也是NCC表面的一种分子标记。本研究根据NCBI上已公布的罗非鱼NCCRP-1基因序列,设计一对带酶切位点的引物,经PCR扩增、酶切、连接等步骤,构建罗非鱼NCCRP-1基因的原核表达质粒p GEX-NCCRP-1,将重组质粒导入至大肠杆菌BL21中,成功表达了NCCRP-1重组蛋白。对影响NCCRP-1表达的IPTG浓度、诱导时间、诱导温度等因素进行了优化,发现在20℃下,采用0.2 mmo I/L IPTG诱导5 h,可以诱导NCCRP-1可溶性重组蛋白的高效表达。而免疫印迹结果显示,经纯化后的重组蛋白可与GST-Tag单克隆抗体发生特异性反应,进而表明表达的重组蛋白是罗非鱼NCCRP-1蛋白。该结果为后续罗非鱼NCCRP-1的单克隆抗体制备以及NCCRP-1相关的功能研究奠定了重要基础。     

红笛鲷仔鱼体内特异性母源抗体降解动力学研究

应用山羊IgG免疫红笛鲷亲鱼,人工催产孵化出仔鱼后,用双抗体夹心法检测仔鱼特异性抗体的降解过程,发现抗体水平随时间变化呈下降趋势且可以持续7d,每尾仔鱼特异性抗体降解量约0.001μg,最低检测限为0.482μg/mL。采用饱和硫酸铵分步盐析与亲和层析等方法纯化红笛鲷仔鱼特异性抗体,结果显示,盐析仔鱼特异性抗体最理想的硫酸铵饱和度为40%－50%;亲和层析分离到两个明显独立的层析峰。SDS-PAGE证明纯化的抗体具有极高纯度,其L、H链分子量分别为29 kD和77.5 kD,抗体分子量约为852 kD。该抗体不仅能够与山羊IgG产生特异性免疫反应,而且能与兔抗红笛鲷IgM抗血清产生免疫反应,因而认为红笛鲷母源抗体可以垂直转移至仔鱼。     

鱼源溶藻弧菌胞外产物的特性研究

溶藻弧菌经胰胨大豆胨琼脂培养基(TSA 2%NaCl)培养48h后,培养物用PBS洗脱、离心,再经孔径0.22μm微孔滤膜过滤,制得胞外产物(Extracellular product,ECP)。经检测,该ECP具有淀粉酶、酪蛋白酶、卵磷脂酶和脂肪酶等4种酶活性,其中淀粉酶的活性最高,酪蛋白酶、脂肪酶活性次之,卵磷脂酶活性较低,未检测出明胶酶及脲酶活性;能溶解断斑石鲈(Pomadasys hasta)、眼斑拟石首鱼(Sciaenops ocellatus)和赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)的红细胞,而不能溶解鸡、羊及O型人红细胞;对小白鼠和石斑鱼的LD50分别为0.08mg/g和0.17mg/g,95%可信限分别为0.06—0.12mg/g和0.07—0.28mg/g;50mmol/L EDTA和100mmol/L苯甲基磺酰氟能使胞外蛋白酶(Extracellular pro-teinase,ECPase)的活性分别下降83.40%和51.32%;ECPase对热稳定性较差,碱性条件下活性较高,其最适温度为50℃,最适pH为8.0。     

无乳链球菌诱导吉富罗非鱼分泌型免疫球蛋白M(sIgM)重链基因的克隆及原核表达

以灭活的无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)诱导后的吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)为材料,构建其头肾SMART cDNA文库,应用同源性克隆和RACE-PCR技术克隆到吉富罗非鱼(O.niloticus)分泌型免疫球蛋白M(sIgM)重链基因的全长cDNA序列并对其进行生物信息学分析。sIgM基因cDNA全长为1 921 bp,开放阅读框(ORF)为1 740 bp,5'端非编码区(5'-UTR)41 bp,3'端非编码区(3'-UTR)140 bp,编码579个氨基酸,N端有信号肽结构。预测分子量(MW)为64.26 kD,理论等电点(pI)为5.36。系统进化树分析显示,吉富罗非鱼(O.niloticus)sIgM与牙鲆(Paralichthys olivaceus)和军曹鱼(Rachycentron canadum)的亲缘关系较近。sIgM基因有4个恒定区。将吉富罗非鱼(O.niloticus)sIgM基因恒定区序列克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,构建原核表达质粒pET28-sIgM,诱导表达后确定最优条件为37℃条件下,IPTG浓度为0.05 mmol/L时诱导4 h蛋白表达量最大。纯化蛋白后经Western blot分析,sIgM融合蛋白与鼠抗His-Tag发生特异结合,表明目的蛋白成功表达。     

尼罗罗非鱼核糖体蛋白S6基因克隆及组织表达分析

核糖体蛋白S6(ribosomal protein S6, RPS6)是构成40S小亚基核糖体的关键蛋白之一,在蛋白质合成、调控细胞周期和凋亡、调节肿瘤细胞增殖和转移等方面具有重要作用。为探究RPS6在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)中的分子结构、表达特性和生物学功能,本研究从尼罗罗非鱼中克隆获得RPS6基因的编码区序列(GenBank登录号：XM＿003454192.4;命名为On-RPS6),并采用qPCR法分析该基因在健康鱼体各组织的分布特征以及无乳链球菌刺激后该基因在鱼体肝脏、脾脏、脑和头肾中的表达模式。结果显示：On-RPS6的开放阅读框长度为750 bp,编码249个氨基酸,理论分子量为28.70 kDa,等电点为10.90。氨基酸序列分析显示,On-RPS6具有一个高度保守的核糖体蛋白S6e结构域,且与其他物种具有较高同源性。系统进化树分析表明,尼罗罗非鱼RPS6与斑马拟丽鱼(Maylandia zebra)RPS6聚为一支,表明二者具有较近的亲缘关系。qPCR结果显示,尼罗罗非鱼各组织均能检测到On-RPS6基因mRNA的表达,且在血液中的表达量...     

溶藻弧菌VcrV基因缺失株的构建及生物学特性

为研究溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统VcrV基因的功能和生物学特性,采用同源重组技术成功构建了溶藻弧菌缺失株ΔVcrV,并用PCR检测其遗传稳定性。结果显示,缺失株遗传稳定;与野生株相比,生长和自凝集能力无显著变化;但生物膜形成能力降低,半致死剂量升高16.5倍;游动性和涌动性极显著升高,细胞粘附能力极显著降低(P<0.01),对H₂O₂和NaCl的耐受性降低;对头孢呋辛、麦迪霉素、克林霉素抗生素敏感度上升,对丁胺卡那、多粘菌素B抗生素敏感度降低;活性氧含量极显著降低(P<0.01),脯氨酸、肽聚糖、β-内酰胺酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶指标均极显著升高(P<0.01)。缺失株生物学特性表明,VcrV基因参与溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统性的致病性和多种生物学功能。     

溶藻弧菌脂多糖对石斑鱼免疫功能的影响

脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是G菌细胞壁中的主要成分之一,是细菌内毒素的主要物质,不仅可引起机体良好的体液免疫应答,而且也可提高机体的非特异性免疫功能。Bog-wald发现LPS能导致实验鱼产生特异性抗体,而且还增强鱼体的免疫吞噬能力;Mac Arthur等报道LPS可提高鲽(pleuronectes platessa)体内巨噬细胞的游走能力;Solem认为LPS可促进大西洋鲑(Atlantic salmon)巨噬细胞的分裂且提高其吞噬活性和鱼体抗感染的能力。本文用溶藻弧菌LPS免疫石斑鱼后,分析了石斑鱼血清抗体效价的变化、LPS对石斑鱼血清溶菌酶、酚氧化酶(PO)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性以及抗菌活力等非特异性免疫指标的影响,以及LPS对石斑鱼免疫保护效果,将为充分利用LPS免疫学特性提供理论依据。       

沼泽生红冬孢酵母生长及产类胡萝卜素培养条件的研究

通过单因素实验和正交实验对沼泽生红冬孢酵母生长和产类胡萝卜素的培养条件进行研究,最适培养条件为葡萄糖40 g/L,牛肉膏10 g/L,酵母膏10 g/L,NaCl 10 g/L,MgSO4.7H2O 0.1 g/L,K2HPO4 2 g/L,KH2PO4 2 g/L,初始pH 6.3,装液量为50 mL/250 mL,摇床转速170 r/min,培养温度为28℃,接种量为10%。在此发酵条件下,培养72 h后,沼泽生红冬孢酵母生物量和类胡萝卜素产量分别达到11.72 g/L和3.55 mg/L。     

南极衣藻谷胱甘肽-S-转移酶基因的表达及其对大肠杆菌低温耐受性的增强作用

谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione-S-transferase, GST, EC2.5.1.18)是生物体内一种重要的抗氧化酶, 为阐明GST在南极衣藻(Chlamydomonas sp. ICE-L)中的具体地位, 采用实时荧光定量PCR对不同温度下南极衣藻的GST基因的表达进行了分析; 并构建了原核表达载体pET28a(+)-GST, 转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达, 通过平板培养法探讨了重组菌E. coli BL21(pET28a(+)-GST)对低温胁迫的耐受性。结果显示, GST在0℃时表达量最高, 最高可达对照组的两倍多; pET28a(+)-GST重组表达载体在E. coli BL21中实现了高效表达, 且主要以包涵体形式存在, 经HisTrap HP柱分离纯化获得高纯度的GST融合蛋白, 并通过SDS-PAGE及Western blot分析得以验证; 对低温胁迫实验发现南极衣藻GST蛋白的表达可以提高重组菌E. coli BL21对低温的耐受性, 说明GST基因对南极衣藻适应南极低温环境具有重要作用。