酿酒酵母海藻糖—６—磷酸合成酶基因克隆及植物表达载体的构建

从耐热性极强的酿酒酵母菌株ＡＳ２．１４１６中分离纯化出总ＲＮＡ和mRNA,以ＡＭＶ逆录酶合成cDNA,采用保守引物,从该cDNA中扩增克隆出tps1基因,对该基因的全序列分析表明,该基因含有１５０７个核苷酸,与国外报道相关基因的同源性达９９．６５。利用ＢamＨⅠSacⅠ切点将tps1基因插入植物表达载体pBin438多克隆位点上,得到tps1基因植物表达载体重组质粒。     

康宁木霉K801纤维素酶cbh2基因的克隆及序列分析*

通过聚合酶链式反应（PCR）技术扩增得到纤维素高产菌株康宁木霉Trichoderma kningii K801纤维二糖水解酶（CBHII）基因全序列,并克隆到pGEM-Teasy Vector。序列分析表明,所克隆的cbh2基因长1611bp,包含了纤维二糖水解酶基因的完整编码区序列,并含有三个真核生物典型的内含子序列,其中四个外显子序列共同编码一个471aa的蛋白质。该序列是国内首次克隆得到的cbh2编码区全序列,与国外报道的T. reesei已知序列的同源性达到99.89％,只有两个碱基差别,而推测的氨基酸序列只有一个位置疏水性氨基酸之间发生替代,在推测的氨基酸序列上发现3个潜在的N-糖基化位点。     

康宁木霉K801纤维素酶cbh2基因的克隆及序列分析

通过聚合酶链式反应（PCR）技术扩增得到纤维素高产菌株康宁木霉Trichoderma k■ningii K801纤维二糖水解酶（CBHII）基因全序列,并克隆到pGEM-Teasy Vector。序列分析表明,所克隆的cbh2基因长1611bp,包含了纤维二糖水解酶基因的完整编码区序列,并含有三个真核生物典型的内含子序列,其中四个外显子序列共同编码一个471aa的蛋白质。该序列是国内首次克隆得到的cbh2编码区全序列,与国外报道的T. reesei已知序列的同源性达到99.89％,只有两个碱基差别,而推测的氨基酸序列只有一个位置疏水性氨基酸之间发生替代,在推测的氨基酸序列上发现3个潜在的N-糖基化位点。     

一株神经节苷脂内切糖苷酶产生菌的分离、鉴定及系统发育分析

从土壤微生物中筛选得到一株产神经节苷脂内切糖苷酶的菌株YW2112, 该酶能特异性水解神经节苷脂中连接神经酰胺和寡糖链之间的糖苷键,是研究神经节苷脂结构与功能的重要工具酶。对分离菌株YW2112进行了形态、生理生化鉴定及16S rDNA序列分析。菌株YW2112为细菌,革兰氏染色阴性,直杆状, 鞭毛周生,菌体大小为(0.6μm～1μm)×(1μm～3μm),V-P实验阳性,甲基红阴性,利用葡萄糖产酸产气。以16S rDNA同源性为基础构建了包括11株相关种属细菌在内的系统发育树,在系统发育树中,分离菌株YW2112 与Enterobacter cloacae 在同一分支,二者的序列相似性为98.6% ,结合形态和生理生化鉴定,将其鉴定为阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）。     

基于国产微滴数字PCR的SNP快速检测技术研究

目的 在法医学领域,现有的SNP检测主要依赖进口,检测工作量大、耗时长且成本较高。微滴数字PCR (droplet digital PCR,ddPCR)作为新一代的PCR技术,可以快速检测低浓度样本DNA,且有较强的抗干扰能力。本研究旨在国产ddPCR平台建立SNP分型检测体系并对其性能进行评估,以探讨ddPCR技术在法医学检验领域的应用价值。方法 在ddPCR平台建立高原适应性EPAS1单倍型(rs115321619、rs73926263、rs73926264、rs73926265和rs55981512)检测体系,测试各位点引物探针特异性,对体系的准确性、稳定性、灵敏度、检材适应性进行评估,并比较了ddPCR和SNaPshot微测序检测体系的抗抑制性,最后对样本地区来源进行测试。结果 ddPCR在2.5 h内即可快速获取检测结果,体系准确性和稳定性好,检测灵敏度为0.312 5 ng,且抗抑制性能力突出。70份测试样本检测结果与背景信息一致。结论 基于ddPCR的SNP检测体系具有准确可靠、简便快速、抗抑制能力强等优势,在法医学快速检验领域有较强的应用潜力,适合法医现场检验需求。     

耐碱性木聚糖酶基因在短小芽孢杆菌中高效分泌表达的研究

从木聚糖酶高产短小芽孢杆菌 (Bacilluspumilus)BP5 1中克隆得到木聚糖酶基因xynA ,将其构建在芽孢杆菌表达载体pWH1 5 2 0中得到重组质粒pWSX1 1。xynA由木糖诱导xylA启动子调控xynA表达。采用同源高效表达策略 ,以原生质体转化方法将pWSX1 1转回原始菌株BP5 1中 ,获得重组菌株BPX1 1。通过木糖诱导重组菌株中的xy nA基因高效分泌表达 ,使木聚糖酶产酶活力比原菌株BP5 1提高了 87% ,同时对重组表达的木聚糖酶的酶学性质进行了初步研究     

酿酒酵母海藻糖-6-磷酸合成酶基因克隆及植物表达载体的构建

从耐热性极强的酿酒酵母菌株AS21416中分离纯化出总RNA和mRNA,以AMV逆转录酶合成cDNA,采用保守引物,从该cDNA中扩增克隆出tps1基因,对该基因的全序列分析表明,该基因含有1507个核苷酸,与国外报道相关基因的同源性达99.6%。利用BamHⅠ和SacⅠ切点将tps1基因插入植物表达载体pBin438多克隆位点上,得到tps1基因植物表达载体重组质粒。     

康宁木霉K801纤维素酶cbh2基因的克隆及序列分析

通过聚合酶链式反应（PCR）技术扩增得到纤维素高产菌株康宁木霉Trichoderma koeningiiK801纤维二糖水解酶（CBHII)基因全序列,并克隆p GEM-Teasy Vector。序列分析表明,所克隆的cbh2基因长1611bpq,包含了纤维二糖解酶基因的完整编码区序列,并含有三个真核生物典型的内含子序列,其中四个外显子序列共同编码一个471aa的蛋白质。该序列是国内首次克隆得到的cbh2编码区全序列,与国外报道的T.reesei已知序列的同源性达到99．89％,只有两上碱基差别,而推测的氨基酸序列只有一个位置疏水性氨基酸之间发生替代,在推测的氨基酸序列上发现3个潜在的N－糖基化位点。