普通牛及其近缘种特异性序列筛选及环介导等温扩增检测方法

近年来,肉制品掺假事件频频发生,亟需建立快速、可靠的肉制品动物源性成分检测方法,保障肉类食品安全。与常规PCR等检测方法相比,环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）方法具有高特异性、高灵敏度、反应快、易操作等优势。基于此,利用生物信息算法筛选普通牛及其近缘种（牦牛、水牛、美洲野牛）的全基因组序列,以获得种间相似性序列,进而建立并优化可用于检测普通牛及其近缘种成分的特异性LAMP方法。最终优化后的LAMP反应体系为：10 μmol·L-1外引物F3和B3各0.25 μL,10 μmol·L-1内引物FIP和BIP各2 μL,2 mmol·L-1 dNTP 2.5 μL,25 mmol·L-1 MgSO4 4 μL,5 mol·L-1 甜菜碱 3.5 μL,8.0 U·μL-1 Bst DNA 聚合酶 1 μL,10×ThermoPol Buffer 2.5 μL,DNA模板2 μL,加双蒸水至25 μL;LAMP反应条件为：65 ℃恒温扩增1 h,80 ℃ 10 min。在扩增产物中加入SYBR GreenⅠ荧光染料后,检测结果可用肉眼直接观察。优化后的LAMP方法在1 h内能特异性地检测出普通牛、牦牛、水牛及美洲野牛成分,检测灵敏度达到0.020 ng·μL-1,且可特异性地检测出市售肉制品中含有牛肉成分的样品。研究所建立的LAMP方法具有高特异性、高灵敏度、反应快速、操作简便和无需精密仪器等特点,可应用于肉制品中普通牛及其近缘种成分的实际检测,为我国肉类食品安全提供了有力保障。