酿酒酵母W5核酸内切酶基因HO的克隆及生物信息学分析

目的:以酿酒酵母W5为出发菌株,对其核酸内切酶基因HO进行克隆及生物信息学分析。方法:首先运用Primer 5.0软件,设计一对扩增HO基因序列的引物,并以酿酒酵母W5全基因组为模板进行PCR扩增,获得酿酒酵母W5核酸内切酶HO基因片段,利用生物信息学技术对该序列进行验证及分析。结果:测序显示HO基因长度为1760bp,无碱基缺失,且该基因序列具有完整的开放读框。该基因编码的HO蛋白包含586个氨基酸残基,强酸性和强碱性氨基酸残基数量有明显差异;HO蛋白等电点为9.56,存在激酶位点,疏水性最大值为1.722,亚细胞定位预测其位于细胞核内,属于碱性胞内蛋白质,并构建了其空间结构模型。结论:对酿酒酵母W5核酸内切酶HO基因序列进行了克隆及生物信息学分析,所得数据可为酿酒酵母遗传背景研究提供一定的理论支持。     

Cre-loxP重组酶技术敲除酿酒酵母丙酮酸脱羧酶编码基因pdc1和pdc5

目的:分别构建含有酿酒酵母丙酮酸脱羧酶基因pdc1和pdc5同源序列loxP-kanMX-loxP的质粒,敲除丙酮酸脱羧酶基因。方法:以两端含40 bp pdc1或pdc5的同源序列为引物,以pUG6质粒DNA为模板,通过PCR扩增loxP-kanMX-loxP基因敲除片段,将其分别插入pMD18-T、pEASY-T3,构建表达载体pTWCL-PDC1与pTWCL-PDC5并测序,构建后的质粒利用醋酸锂转化法转化酿酒酵母H5,经筛选鉴定后进行摇瓶发酵试验。结果:分别含有1693、1672 bp目的片段pdc1-loxP-kanMX、pdc5-loxP-kanMX的质粒pTWCL-PDC1与pTWCL-PDC5构建成功,发酵试验显示重组酿酒酵母H5-01与H5-02较原始菌株的乙醇产量分别下降了14.53%与17.54%,证明pdc1或pdc5基因被敲除。结论:利用Cre-loxP重组酶技术分别敲除了酿酒酵母pdc1和pdc5基因,为后续在酿酒酵母中连续敲除pdc1和pdc5奠定了良好的技术基础。