伪结核棒状杆菌pld基因无痕缺失株构建及其生物学特性及致病性研究

伪结核棒状杆菌是一种可以感染多种动物和人的兼性胞内寄生病原,主要引起被感染动物慢性化脓性炎症反应。[目的]为进一步评价磷脂酶D基因(pld)在伪结核棒状杆菌感染致病中的作用。[方法]本研究采用同源重组技术,在不引入外源基因情况下,构建伪结核棒状杆菌pld无痕缺失株。通过比较pld缺失株和野生株的菌落形态及生长曲线、体外对巨噬细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放及其在胞内的繁殖情况以及体内感染小鼠致死率及促炎细胞因子分泌水平,研究pld与该病原感染致病之间的关系。[结果]无痕缺失pld对伪结核棒状杆菌的菌落形态及生长无明显影响。与野生株ATCC 19410和XH02相比,ATCC 19410Δpld和XH02Δpld失去了与马红球菌ATCC 6939的协同溶血功能,所感染巨噬细胞的LDH释放水平显著下降,胞内细菌数量显著降低;体内试验发现ATCC 19410Δpld对小鼠的致死率、肝脏和脾脏载菌量以及腹水及脏器促炎细胞因子水平均低于ATCC 19410。[结论]成功构建了伪结核棒状杆菌pld无痕缺失株。证实pld在该病原体外感染引发巨噬细胞死亡以及体内感染小鼠致病中具有重要作用。     

基于CRISPR/Cas9构建伪结核棒状杆菌cp40敲除株及其生物学特性与致病性研究

【目的】建立更高效的伪结核棒状杆菌(Corynebacteriumpseudotuberculosis, Cp)靶基因敲除方法,敲除丝氨酸蛋白酶编码基因(cp40),并评价其在Cp感染致病中的作用。【方法】以pECXK99E为载体,Cp宣汉株(XH02) cp40为靶基因,设计含CRISPR/Cas9的间隔序列(spacer)、导向RNA (guide RNA, gRNA)和cp40上下游同源臂的表达质粒(pEC-cp40gRNA-HDarm),转入含pCas9gRNA-ccdB的Cp感受态细胞,构建CRISPR/Cas9基因编辑系统以敲除cp40基因。通过比较cp40敲除株和野生株的菌落形态及生长曲线、体外对J774A.1巨噬细胞活力及白细胞介素(interleukin, IL)-1β分泌,以及体内感染小鼠致死率及脏器载菌水平,研究cp40与该病原感染致病之间的关系。【结果】应用所建立的双质粒CRISPR/Cas9编辑系统成功获得XH02的cp40敲除株(XH02Δcp40)。与XH02相比,XH02Δcp40在菌落形态及生长曲线上无明显差异,但XH02Δcp40感染J774A.1巨噬细胞的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)释放(P=0.06)、碘化丙锭(propidium iodide, PI)染色比例均降低(P<0.01),体内感染小鼠致死率下降50%,并且被感染小鼠肝脏和肾脏中Cp含量显著降低(P<0.001)。【结论】本研究所建立的CRISPR/Cas9编辑系统可较高效敲除Cp基因,证实cp40是该病原感染致病相关基因,为后续基于该基因研究Cp感染致病机制奠定基础。     

伪结核棒状杆菌感染影响巨噬细胞IL-1α表达、成熟及分泌的机制研究

【目的】伪结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis,Cp)感染动物常引起内脏和体表淋巴结脓肿,以被感染部位炎性细胞因子大量增加为特征。研究Cp感染小鼠巨噬细胞对IL-1α成熟分泌的影响及机制。【方法】采用荧光定量PCR、ELISA和Western blotting等方法,首先检测Cp(ATCC19410、XH02)及其磷脂酶D基因(pld)缺失株(ATCC19410Δpld、XH02Δpld)感染巨噬细胞对IL-1α表达及成熟分泌的影响,进而以Ca²⁺螯合剂(EDTA、EGTA+Mg²⁺和BAPTA-AM)、calpain抑制剂(calpain inhibitor Ⅲ、calpain inhibitor Ⅳ和EST)处理巨噬细胞,观察对Cp感染介导IL-1α成熟分泌的影响。【结果】Cp感染巨噬细胞后,IL-1α mRNA表达及分泌显著增加,与ATCC19410、XH02感染巨噬细胞相比,ATCC19410Δpld、XH02Δpld感染细胞IL-1α表达及分泌显著下降。Cp感染引起巨噬细胞内Ca²⁺浓度显著增加,calpain活性增强,而缺失pld的Cp感染巨噬细胞内Ca²⁺浓度显著下降,calpain活性降低。EDTA、EGTA+Mg²⁺、BAPTA-AM、calpain inhibitor Ⅲ、calpain inhibitor Ⅳ处理Cp感染的巨噬细胞,巨噬细胞的IL-1α表达及分泌显著下降。【结论】Cp感染可激活巨噬细胞IL-1α表达和成熟分泌,磷脂酶D参与Cp感染巨噬细胞介导的IL-1α成熟分泌。Cp感染巨噬细胞介导IL-1α成熟与分泌与胞内Ca²⁺浓度增加、激活钙蛋白酶有关。