以潮霉素B抗性为选择标记的深黄被孢霉原生质体转化

利用亚硝基胍(MNNG)诱变方法筛选了一株深黄被孢霉潮霉素B敏感型菌株M6-22-4。采用PEG介导的方法,将含有E.coli潮霉素B抗性标记的PD4质粒转入敏感株M6-22-4原生质体,并在潮霉素B浓度为400μg/mL的选择培养基上筛选转化子,获得了1.6~2.8个转化子/μg质粒DNA的转化频率。稳定性实验表明,质粒线性化后所获得的转化子在PDA培养基上传代10代以后,转接到选择平板上有31.6%仍具有HmB抗性;随机挑选了3个转化子,通过PCR方法检测到潮霉素抗性基因的存在,Southern杂交发现,潮霉素抗性基因已经以1~2拷贝数整合到深黄被孢霉M6-22-4染色体上,这是深黄被孢霉转化系统的首次报道。     

传染性法氏囊病病毒反向遗传技术发展及其应用

传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)是双股双节段RNA病毒科的主要代表,其主要侵害鸡的中枢免疫器官法氏囊,引起的传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是危害养禽业健康发展的重要免疫抑制病。IBDV反向遗传技术诞生的近20年来,病毒拯救技术不断完善,病毒基因功能研究更为深入,而且基于此的新型疫苗的研究也有较大进展。本实验室在该领域也做了比较系统和深入的工作。本综述对IBDV致病机制和防控研究具有重要启示意义。     

鸡传染性法氏囊病病毒的反向遗传研究

鸡传染性法氏囊病(infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)引起的一种危害鸡的急性、高度接触性、免疫抑制性传染病。该病由Cosgrove于1962年作为一种新的疾病首次报道,最初病死率并不高(5%左右),但到了上世纪80年代末90     

鸡贫血病毒衣壳蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备

利用PCR技术,以pPrpo-VP1为模板扩增得到鸡贫血病毒的衣壳蛋白基因(VP1),以T4多聚核苷酸激酶磷酸化处理、纯化后,克隆至表达载体pET-30a(+) 中,从而构建了原核表达质粒pET30-VP1.将pET30-VP1转化至感受态细胞E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析,可见约45kDa的目的蛋白获得表达.该蛋白经亲和层析纯化后,免疫6-8w的雌性Balb/c鼠,三次免疫后,采血分离血清,制得抗VP1的多克隆血清.以纯化的VP1为包被抗原,用ELISA方法检测,制备的血清效价达12800×以上.以Western blot 检测,该血清可与目的蛋白发生特异性反应,证明其具有良好的免疫原性.VP1蛋白的成功表达及其多克隆抗体的制备为进一步研究VP1蛋白的功能及开展CAV疫苗及诊断制剂的研制奠定了基础.     

重组痘病毒表达SARS冠状病毒纤突蛋白及其免疫原性分析

对牛痘病毒弱毒株表达的SARS冠状病毒纤突蛋白(Spike protein,S)的免疫原性进行分析与比较.以减毒痘病毒(WR株)为载体重组了SARS冠状病毒全长S基因(rWR-SARS-S).SDS-PAGE和Western blot试验表明,迁移率约为190kD的重组SARS S蛋白可在HeLa细胞中表达,而且可以被鸡抗SARS全病毒高免血清识别,具有特异免疫反应原性.进一步研究表明,rWR-SARS-S感染的细胞在IFA试验中可与鸡抗SARS的高免血清发生特异反应,具有良好的敏感性和特异性.以104PFU的rWR-SARS-S免疫BALB/c小鼠产生的抗体在间接ELISA试验中可以被S蛋白识别,产生特异抗原抗体反应.利用痘病毒表达的SARS冠状病毒S蛋白具有良好的抗原性和生物学活性,可替代SARS冠状病毒全病毒,为研究安全、敏感和特异的重组诊断抗原奠定了重要基础.     

传染性法氏囊病病毒VP3抗原表位的鉴定

利用肽扫描技术对4株IBDV VP3的单克隆抗体(HRB-3F、HRB-7B、HRB-7C和HRB-10E)的抗原表位进行了研究.通过Western blot和ELISA鉴定,将HRB-3F和HRB-7B的抗原表位定位于VP3 109～119 aa(位于IB-DV聚合蛋白的864～874 aa),HRB-7C和HRB-10E的抗原表位定位于VP3 177～190 aa(位于IBDV聚合蛋白的932～945 aa).进一步检测其反应原性及免疫原性,结果表明,这两个表位均能与抗IBDV阳性血清反应.将这两个表位短肽免疫BALB/c小鼠,其血清可以和IBDV反应,具有较好的免疫原性.与D6948、HK46和UK661等多株IBDV相应区域的同源性进行了比较,结果显示,这两个表位在多种毒株中同源性为100%.通过IBDV VP3抗原表位的研究,筛出两个新的保守线性表位并进行精确定位,对进一步分析IBDV结构与功能以及建立以表位为基础的抗原抗体诊断方法具有重要的意义.     

禽呼肠孤病毒σC基因在杆状病毒表达系统中的表达及其活性鉴定

本研究利用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统构建重组禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)σC基因的杆状病毒,感染sf9细胞获得表达重组蛋白。首先,将ARVσC基因克隆至pFastBacHTA载体,构建重组供体载体pFσC,将其转化大肠杆菌DHl0Bac感受态细胞,使σC基因整合到Bacmid穿梭载体中,获得重组穿梭载体BacmidσC。通过脂质体介导将其转染到sf9昆虫细胞中,获得重组杆状病毒rBacσC。通过Western Blot、间接免疫荧光试验(IFA)进行检测,结果显示:σC蛋白在重组杆状病毒rBacσC感染的sf9昆虫细胞中获得正确表达,分子质量约为37kD,表达的σC蛋白具有良好的反应活性。     

传染性法氏囊病病毒的自然重组

传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)是双RNA病毒科(Birnaviridae)的典型代表,其引起的传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD)是危害养禽业的一种重要免疫抑制病和致死性传染病。IBDV的自然重组给疫病防控带来了新风险。本文综述了IBDV基因组节段重组和基因内重组的主要类型,分析了其形成机制及生物学意义,提出了该类病毒遗传演化研究以及疫病综合防控的新思路。     

鸡传染性法氏囊病病毒Gt株VP5基因缺失株感染性克隆的构建

传染性法氏囊病病毒 (IBDV)是双链,双节段RNA病毒,其基因组由A、B两个节段组成,编码结构蛋白VP1-VP4和非结构蛋白VP5。【目的】利用反向遗传操作构建拯救VP5基因缺失重组IBDV。【方法】利用体外定点突变技术,缺失IBDV Gt株VP5基因,通过多重PCR在基因组两端分别引入锤头状核酶序列(HamRz)和丁肝病毒核酶序列(HdvRz)。将带有核酶序列的IBDV基因组插入载体pCAGG的b肌动蛋白启动子下游,构建了IBDV感染性克隆pCAGGmGtA △VP5HRT,将该感染性克隆与pCAGGmGtBHRT共转染DFⅠ细胞。【结果】RT-PCR和间接免疫荧光均显示获得重组病毒,将其命名为rmGtA △VP5。IBDV VP5基因缺失感染性克隆的成功构建为从分子水平上深入研究vp5基因功能奠定了基础。