马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)细胞粘附分子3(Pm-CAM3)基因的克隆与表达分析

细胞粘附分子3 (cell adhesion molecule 3, CAM3)是免疫球蛋白家族(immunoglobulin family, IgSF)的一员,在细胞黏连、外源病原体的识别等方面具有重要作用。本实验利用末端快速克隆(RACE)技术,克隆获得马氏珠母贝(Pinctada facata martensii)细胞粘附分子3的全长序列(Pm-CAM3),并使用荧光定量PCR(Real-time PCR, q RT-PCR)技术检测了Pm-CAM3在马氏珠母贝不同组织中的表达模式。结果显示,Pm-CAM3基因全长2 245 bp。其中5'UTR 335 bp,3'UTR 166 bp,开放阅读框(ORF)长度为1 744 bp,共编码581个氨基酸;预测其相对分子量为63.21 kD,等电点为5.07,脂溶指数(aliphatic index)为67.21;总平均亲水性(grand averageofhydropathy, GRAVY)为-0.549,属于亲水性蛋白;Pm-CAM3具有跨膜结构域,其胞外区域具有一个Ig SF家族典型的Ig结构域以及一个Ig-like结构域。多序列比对结果显示,Pm-CAM3在物种间的保守性较低,其中Pm-CAM3与太平洋牡蛎的CAM3 (Crassostrea gigas, Cg-CAM3)的氨基酸序列相似性最高,但仅为37%。qRT-PCR分析表明Pm-CAM3在马氏珠母贝的9个组织中均有表达,其中在鳃中的表达量最高(p<0.05)。     

马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)近交家系与其杂交子代DNA甲基化差异分析

2012年4月,利用马氏珠母贝全同胞家系进行家系内与家系间交配组合构建了近交家系(A与D)与杂交家系(B与C)。贝龄2龄时,比较家系生长性状差异,利用甲基化敏感多态性扩增技术(MSAP)检测了4个家系甲基化水平的差异,估计了甲基化比例与生长性状平均值相关性系数。结果表明,家系杂交子代的平均壳长、平均壳高、平均壳宽与平均体重均值大于近交家系,性状优势率为8.5%~24.7%;近交家系与杂交家系的总条带数和甲基化比例均存在显著性差异(p0.05)。近交家系A和D获得的总条带数分别729.0±19.6与717.3±28.2,甲基化水平分别为(10.0±0.9)%与(8.5±0.4)%;杂交家系B和C获得的总条带数分别为703.0±10.7与726.3±18.8,甲基化比例分别为(5.9±0.7)%与(5.7±0.9)%;家系的平均壳长、平均壳高、平均壳宽与平均体重性状与甲基化均存在明显负相关,相关系数分别为-0.849、-0.751、-0.674和-0.652。     

斑纹小贻贝(Mytella strigata)基础生物学与生物入侵

生物入侵是继栖息地破坏之后,全球生物多样性丧失的第二大驱动因素。近年来,原产于南美洲地区的斑纹小贻贝（Mytella strigata）在印度-西太平洋海区被陆续报道,而我国台湾、广东、海南、福建、广西等省份同样发现斑纹小贻贝,且其已经建立可自我维持的种群。但是,作为一种新型入侵生物,斑纹小贻贝尚未引起国内海洋管理部门和科研人员足够重视,亟待查明其在我国沿海的分布现状、扩散趋势和生态影响等,为斑纹小贻贝的检测、监测、防控和管理提供科学依据。综述了斑纹小贻贝的基础生物学特征和全球生物入侵现状,发现国内的斑纹小贻贝源于南美洲加勒比海地区,于2014年左右通过船舶压舱水或船体生物污损的形式侵入我国南方沿海并迅速扩散。此外,斑纹小贻贝在我国的生物入侵处于"引进-传播"阶段,即将大规模扩繁,因此亟需开展应急清除行动。     

马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)Pm-HK基因的克隆及其对温度胁迫的响应

己糖激酶(hexokinase, HK)是糖酵解过程中的首个限速酶。本实验利用RACE技术克隆获得了马氏珠母贝HK (Pm-HK)基因,并对其基因和氨基酸序列结构特征进行了生物信息学分析,同时采用荧光定量PCR技术分析了该基因在不同组织的表达模式及不同温度下的时序表达模式。序列分析表明,Pm-HK cDNA序列全长为2 403 bp,其中开放式阅读框1 548 bp,5'UTR 74 bp,3'UTR 781 bp,共编码515个氨基酸,分子量为57.67 kD,理论等电点为6.08。结构域分析发现Pm-HK具有两个完整的保守功能域Hexokinase_1、Hexokinase_2,以及两个Glucose-6-Phosphate结合位点、三个Glucose结合位点,两个ATP结合位点。多序列比对结果表明Pm-HK与太平洋牡蛎HK同源性最高,为81%;系统进化分析发现,Pm-HK与太平洋牡蛎等贝类HK聚为一支。组织表达定量分析结果显示,Pm-HK在马氏珠母贝肝胰腺中显著高表达;对不同温度下鳃组织中Pm-HK的时序表达分析发现,在处理12 h后各时间点低温组(12℃) Pm-HK基因表达水平最高,且均显著高于中低温组(17℃)、对照组(22℃)和高温组(32℃)。以上结果表明Pm-HK可能参与马氏珠母贝的低温胁迫响应。该研究为进一步探索Pm-HK在马氏珠母贝在温度适应性中的作用提供了基础资料。     

裸体方格星虫染色体组型分析

将裸体方格星虫(Sipunculus nudus)置于0.04%秋水仙素溶液中暂养12h,取其体腔液,用盐度6.50‰过滤海水低渗45min,1500r/min离心8min,卡诺氏液固定1h,热滴片,5% Giemsa染色,显微观察、摄影,根据Levan等的分类标准进行染色体组型分析.结果表明,裸体方格星虫的染色体基数为x=17,2n=2x=34,染色体组型为2n=2x=26m 8sm,NF=68.除第2、3、4、8对染色体为亚中部着丝粒染色体(sm)外,其余均为中部着丝粒染色体(m).臂比值变化范围是1.211～2.617.未发现性染色体和随体.     

利用微卫星标记分析马氏珠母贝4个养殖群体遗传结构

2007年4月,从马氏珠母贝基础群体选取2、4、32和158个亲本分别繁殖4个子代群体,分别命名为P1、P2、P3和P4。2009年7月,从这4个子代群体随机取样30个个体,利用7对微卫星引物分析其遗传结构。结果表明,7对微卫星引物共检测到22个等位基因,每个座位的等位基因数目为2~4个,平均等位基因数为3个,平均有效等位基因数为2.3193。P1、P2、P3和P4群体平均观测杂合度分别为0.4737、0.5489、0.6767和0.7143;P1、P2、P3和P4群体平均期望杂合度分别为0.4737、0.5489、0.6767和0.7143;P1、P2、P3和P4群体的多态信息含量分别为0.4472、0.4224、0.4726和0.4930。本结果表明4个养殖群体均具有较高的遗传多样性,而且有效亲本数目对子代遗传结构有较大的影响,这为马氏珠母贝的遗传育种提供依据。     

马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)Pm-HSP70基因的克隆及其对温度胁迫的响应

本实验利用RACE技术克隆获得了马氏珠母贝HSP70 (Pm-HSP70)基因,并对其基因和氨基酸序列结构特征进行了生物信息学分析,同时采用荧光定量PCR技术分析了该基因在不同组织的表达模式及不同温度下的时序表达模式。序列分析表明,Pm-HSP70 cDNA序列全长为2 215 bp,其中开放式阅读框1 899 bp,5'UTR 107 bp,3'UTR 209 bp,编码632个氨基酸,理论蛋白分子量为69.44 kD,理论等电点为5.61。该蛋白具有HSP70家族典型的结构域HSP70,以及ATP结合位点、细胞质特征性保守序列和3个HSP70家族标签。多序列比对结果表明Pm-HSP70与菲律宾蛤仔HSP70同源性最高,为80%;系统进化分析发现,Pm-HSP70与菲律宾蛤仔等贝类HSP70聚为一支。组织表达定量分析结果显示,Pm-HSP70在马氏珠母贝多个组织中均有表达,在肝胰腺中表达量最高,其次是性腺;对不同温度下鳃组织中Pm-HSP70的时序表达分析发现,在处理后各时间点高温组(32℃)基因表达水平最高,且均显著高于对照组(22℃)和低温组(17℃)。以上结果表明Pm-HSP70可能参与马氏珠母贝的高温胁迫响应。该研究为进一步探索Pm-HSP70在马氏珠母贝温度适应性中的作用提供了基础资料。     

马氏珠母贝4个壳色选育系F_1遗传结构的AFLP分析

本研究从湛江流沙港马氏珠母贝养殖群体中挑选不同壳色个体为亲本,共构建了黑(BS)、红(RS)、黄(YS)和白壳色(WS)4个壳色选系F1,然后分别在4个壳色选育系F1中随机取样,利用3对AFLP引物分析其遗传结构与遗传分化。结果表明,每对引物的扩增位点数在104～109之间,共得到331个扩增位点;BS、RS、YS和WS壳色选系F1的多态位点比例分别为49.2%、49.5%、51.6%和63.4%,Shannon's多样性指数分别为0.1884、0.1886、0.1896和0.1954,4个壳色选育系F1的遗传分化系数(Fst)为0.1972。本研究说明经过一代壳色纯化4个壳色选育系F1出现显著遗传分化,也为马氏珠母贝壳色系选育或选育系间杂交提供了参考依据。     

光裸星虫Cdc25基因的克隆及在卵母细胞中的表达分析

细胞分裂周期蛋白25(cell division cycle 25,Cdc25)是一种重要的双特异性磷酸酶,对卵母细胞减数分裂进程和胚胎发育具有重要的调控作用.本研究利用RACE技术克隆获得了光裸星虫(Sipunculus nudus)Cdc25(Sn-Cdc25)cDNA 全长.Sn-Cdc25全长为4 130 bp,其中3'UTR 为 1 849 bp,5'UTR 为427 bp,开放阅读框为1 854 bp,编码617个氨基酸.序列分析显示,Sn-Cdc25蛋白分子量为69.58kD,具有M相诱导磷酸酶结构域(M-phase inducer phosphatase domain)和硫氰酸酶同源结构域(rhodanese-like domain)两个典型的Cdc25蛋白结构域,以及能催化去磷酸化过程的活性位点序列HCX5R.多序列比对发现Cdc25同源蛋白的C端同源性较N端的高.三级结构预测表明Cdc25同源蛋白及其活性位点的三级结构构象高度相似.motif分析中共发现5个motifs,其中motif 1和motif 2分别为Paxillin LD基序和MYND结构域结合基序.系统进化树分析显示,无脊椎动物和脊椎动物的Cdc25分别聚为两大支.RT-qPCR结果显示,在不同发育时期卵母细胞中,Sni-Cdc25的表达差异显著,具有两个峰值,从卵黄形成初期至卵黄旺盛合成后期(O1～O3)Sn-Cdc25表达量上升可能与Cdc25促进DNA的复制过程相关;而从体腔液中进入到肾管后(O4～O5),表达量的迅速上升可能有利于成熟促进因子(maturation promoting factor,MPF)的活化.研究结果为深入认识星虫动物卵母细胞发育调控机制和优化人工繁育技术积累基础资料.     

马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)PmHEX基因的功能研究

几丁质是软体动物贝壳有机框架的重要成分,其代谢在贝壳矿化中发挥重要作用。β-N-乙酰-己糖胺酶(HEX, EC3.2.1.52)是几丁质代谢的关键水解酶。为了探究马氏珠母贝β-N-乙酰-己糖胺酶(Pm HEX)(登录号:MF555152)在贝壳形成中的作用,本研究利用原位杂交(ISH)技术检测Pm HEX基因在外套膜的定位,结果显示Pm HEX的mRNA主要分布于外侧褶的外上皮细胞、中褶的内侧上皮细胞和内褶上皮细胞。利用RNAi技术抑制Pm HEX表达后,Pm HEX在边缘区和套膜区的表达量均显著下调;SEM观察发现实验组的棱柱层和珍珠层的微观结构都出现不同程度的紊乱。综上所述,Pm HEX可能通过影响几丁质代谢,参与马氏珠母贝贝壳棱柱层和珍珠层的矿化过程。