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目的研究巴曲酶在毕赤酵母菌中的表达。方法按Pichiapastoris偏好密码子人工合成巴曲酶全基因,克隆到酵母分泌型表达载体pPICZaA中,将重组载体酶切线性化后经电转化转入X-33。筛选鉴定转化子.经摇瓶发酵甲醇诱导,酵母菌分泌表达有凝血活性的巴曲酶。经SDS-PAGE电泳确定其分子量为33.0 kDa.免疫印迹证明重组巴曲酶具有天然巴曲酶的免疫活性。结果经发酵条件的优化.发酵罐的表达量达到25000Ku/L发酵液。从每升发酵液中可纯化出11.0mg重组巴曲酶。结论巴曲酶毕氏酵母菌成功的构建.为重组巴曲酶止血药的开发奠定了基础。 相似文献
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目的对重组定点突变巴曲酶的酶学性质进行研究,为开发成临床用药奠定基础。方法测定不同的温度、pH缓冲液和金属离子等条件对重组定点突变巴曲酶活性的影响。结果重组定点突变巴曲酶的最适pH值在6.5~7.5之间。该酶在50℃以下活力保持90%以上,但当温度超过60℃时,该酶已完全失活。Ca^2+和Na^+离子对酶的稳定性无明显影响,而Mg^2+、K^+、Mn^2+离子则表现为激活作用,Zn^2、+Cu^2+、Fe^2+、Co^+离子则表现为明显的抑制作用。结论重组定点突变巴曲酶在中性条件下比较稳定,它不耐高温,金属离子对其活性有一定的影响。 相似文献
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目的 为避免毕赤酵母分泌的Kex2蛋白酶对发酵液中所表达的巴曲酶的降解.利用重叠PCR方法对巴曲酶基因进行定点突变,将巴曲酶基因第45位的Arg突变为Lys.方法 将突变后的基因克隆到酵母分泌型表达载体pPICZαA中,将重组载体酶切线性化后经电转化转入巴斯德毕赤酵母细胞,筛选鉴定转化子,经摇瓶发酵甲醇诱导,酵母菌分泌表达有凝血活性的定点突变巴曲酶,经SDS-PAG电泳、免疫印迹确定其分子量为32 kD.结果发酵罐的表达量达到52 KU/ml发酵液,较重组天然巴曲酶的表达量提高了73.3%.结论 定点突变巴曲酶的表达量比重组天然巴曲酶的表达量有显著提高,表达的突变巴曲酶同样具有凝血活性. 相似文献
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目的研究真核表达的textilinin-1蛋白纯化品对纤溶酶抑制作用。方法根据textilinin-1的天然氨基酸序列,按照毕氏酵母偏好密码子进行优化,合成textilinin-1基因,重组到pPICZα载体上,并转化至Pichia p.X-33菌种中,实现高效分泌表达,并进行重组textilinin-1活力单位的定义及小鼠断尾试验。结果通过高密度发酵及两步柱层析纯化,最终从10L发酵液中得到6g纯度达97.0%以上的重组textilinin-1。活性研究表明,重组textilinin-1对纤溶酶的活性具有抑制作用,并对tPA所致的小鼠出血倾向有一定的抑制作用。结论重组textilinin-1可抑制纤溶酶活性,并对纤溶性出血小鼠模型有止血作用,具有开发为止血药的潜力。 相似文献
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用微卫星标记定位小麦T型CMS的恢复基因 总被引:17,自引:1,他引:17
以T型细胞质雄性不育系 75 336 9A×恢复系 72 6 9 10的F2 群体作为育性调查和基因定位群体。通过育性分析 ,确定该恢复系含有 2个主效恢复基因 ;结合群分法 ,对恢复基因进行了SSR分子标记定位 ,在 2 30对微卫星引物中 ,微卫星标记Xgwm136和Xgwm5 5 0分别与 2个主效恢复基因连锁。这两个标记与Rf基因之间的遗传距离分别为 6 7cM和 5 1cM ,从而将该恢复基因定位在 1AS、1BS染色体上。 相似文献
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目的对毕赤酵母表达的textlinin-1(Q8008)进行分离纯化,并对其抑制plasmin活性的性质进行研究。方法构建表达Q8008pachia pastoris工程菌,经发酵、纯化得到纯度达95%以上的Q8008。考察不同的温度、pH缓冲液和金属离子等条件对Q8008抑制plasmin活性的影响。结果 Q8008在中性条件下比较稳定,其最适pH值为7.0,最适温度为40℃,在30~50℃相对酶活力在90.0%以上;有2个金属离子对Q8008活性测定方法的影响产生了显著性差异,Zn2+起激活作用,Co2+起抑制作用,其余金属离子均无显著性差异。结论 Q8008在中性pH下抑制活性稳定;在50℃以下,受温度变化影响较小;金属离子对其抑制活性测定有一定影响。 相似文献
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目的观察词内消癖丸活血化瘀、促进小鼠耳廓毛细血管开放,改善微循环的功能,探讨调内消癖丸对小鼠耳廓微循环的影响。方法采用直接给药的试验方法。结果调内消癖丸能促进小鼠耳廓毛细血管开放,改善微循环(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。结论调内消癖丸能活血化瘀、改善微循环为临床用药提供依据。 相似文献
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