沙门伤寒杆菌内膜蛋白GsiD的表达纯化与相互作用北大核心

[目的]克隆沙门伤寒杆菌gsiD编码序列并在大肠杆菌表达菌株Rosetta(DE3)进行过表达,纯化GsiD蛋白质并研究其相互作用关系。[方法]使用GFP作为融合蛋白质标签,优化蛋白质表达和纯化过程,使用位于GFP末端的8×His作为标签进行Ni柱纯化。Gsi A、B、C和D之间的相互作用通过细菌双杂交方法进行验证。[结果]成功构建gsiD过表达载体,优化了GsiD的表达和纯化条件,每1 L培养基可获得约0.4 mg的GsiD蛋白质;内膜蛋白GsiD能够和内膜蛋白质Gsi C发生相互作用,同时GsiD能够和ATP结合蛋白质Gsi A发生相互作用,却不会和Gsi B发生相互作用。[结论]首次克隆并研究了沙门伤寒杆菌gsiD基因,为进一步研究谷胱甘肽转运的机制奠定基础。     

缓激肽生物合成及其对心肌细胞缺氧复氧保护作用

[目的]获得有活性的缓激肽药物,探讨缓激肽在心肌细胞缺氧复氧过程中的保护作用。[方法]利用PCR方法构建p Waldo-BK质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株,优化诱导剂IPTG浓度和表达温度;利用镍柱亲和层析和分子筛纯化缓激肽融合蛋白质,利用GFP荧光In-gel检测蛋白质的表达情况;构建心肌细胞缺氧复氧模型,检测缓激肽对细胞的保护作用。[结果]成功构建p Waldo-BK表达载体,0. 2 mmol/L IPTG于25℃诱导培养20 h,能够获得高表达的目标蛋白质; In-gel荧光检测证实,融合蛋白GFP能够发出绿色荧光;心肌细胞缺氧复氧模型证实缓激肽能够有效保护心肌细胞。[结论]0. 2 mmol/L IPTG、25℃诱导表达20 h,得到散发绿色荧光的融合蛋白,每1L BL21(DE3)细胞培养基能够获得缓激肽约0. 55 mg,且最终获得的缓激肽能够有效保护心肌细胞对抗缺氧复氧刺激。     

大肠杆菌UvrB基因的克隆、表达与功能研究

[目的]在大肠杆菌表达系统表达UvrB蛋白,优化其表达和纯化的条件,并初步研究其对抗紫外线伤害的功能。[方法]克隆大肠杆菌MG1655菌株UvrB编码序列,采用酶切连接的方法构建表达载体p Waldo-GFP-UvrB,并转入BL21(DE3)表达菌株诱导蛋白质表达,采用Ni-NTA亲和层析以及分子筛层析的方法纯化蛋白质,采用紫外光刺激的方法研究其细胞内功能。[结果]成功构建UvrB表达载体,获得UvrB在BL21(DE3)中重组菌株,其表达条件为22℃,0. 2 mmol/L IPTG诱导20 h,UvrB以可溶蛋白的形式存在。SDS-PAGE结果显示UvrB蛋白质分子量约76 k Da与预期相符;经纯化后UvrB蛋白质得率约为0. 6 mg/L培养基,纯度> 85%,为其进一步研究奠定了基础。[结论]研究克隆并构建了大肠杆菌UvrB蛋白的原核表达体系,优化了其纯化方案,得到纯度> 85%的可溶UvrB蛋白质,为进一步研究UvrB蛋白质功能奠定了基础。     

TAT介导多肽药物过表达纯化和穿膜活性检测

目的:获得NR2B羧基端多肽(NR2Pep),探讨TAT-NR2Pep在细胞中的跨膜特性。方法:利用酶切连接方法构建p Waldo-TAT-pep质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,检测不同浓度诱导剂和不同温度对蛋白质表达的影响;利用镍柱亲和层析及分子筛方法纯化TAT-NR2Pep-GFP融合蛋白,利用GFP发荧光的特性采用In-gel检测蛋白质的表达情况;以融合蛋白C端His标签特异性抗体,通过Western印迹确定融合蛋白的表达;荧光显微镜下观察TAT-NR2Pep-GFP融合蛋白在CHO和C2C12等细胞中的跨膜活性。结果:构建了TAT-NR2Pep-GFP表达载体,重组菌经0.1 mmol/L IPTG于22℃诱导20 h能够表达较多高质量的目标蛋白;In-gel荧光检测证实融合蛋白TATNR2Pep-GFP拥有正确构象,GFP能够发出绿色荧光;Western印迹分析表明融合蛋白相对分子质量符合预期;细胞穿膜实验证实TAT能够介导多肽穿过细胞膜。结论:原核表达并纯化得到TAT-NR2Pep-GFP融合蛋白,该蛋白散发绿色荧光,能够穿过细胞膜。     

大肠杆菌细胞周质底物结合蛋白gsiB基因的克隆及其表达条件的优化

为深入研究大肠杆菌谷胱甘肽转运系统的蛋白质结构和功能, 对该系统中的gsiB基因进行了克隆和表达条件的优化。根据大肠杆菌谷胱甘肽转运系统中底物结合蛋白gsiB基因序列, 利用PCR方法扩增到该基因的编码区序列, 利用SLIC (Sequence and ligation–independent cloning)方法直接将其插入pWaldo-GFPe中, 成功构建了重组表达质粒pWaldo-GFP-GsiB。将重组质粒转化不同的大肠杆菌表达菌株进行诱导表达, 通过改变培养温度和IPTG浓度等条件, 得到了能够大量表达目标蛋白的重组子。结果表明: 大肠杆菌BL21(DE3)是 gsiB基因表达的最佳宿主菌; 18℃低温诱导培养有利于gsiB基因的大量表达; 0.1 mmol/L IPTG足够诱导gsiB基因表达, 增加IPTG浓度(0.1 mmol/L~1.0 mmol/L)并不能明显地促进gsiB基因的表达。Western blotting结果显示目标蛋白质有表达, 其分子量大小与预期相符。     

云南鱼类(yunnanolepids)的新发现──曲靖异云南鱼(Heteroyunnan-olepis qujingensis gen.et sp.nov.)

本文记述了云南鱼类一新属新种──曲靖异云南鱼（Heteroyunnanolepisqujingensisgen.etsp．nov．）。它与已知云南鱼类的主要区别在于：1）眶下沟通过后缘片;2）不具眶前凹槽而具眶前凹。基于对新属详细的描述和比较,对胴甲类中“后缘片”和“前鳃盖沟”的同源关系,眶前凹槽和眶前凹相互关系做了尝试性的探讨。     

云南鱼类（yunnanolepids）的新发现—曲靖异云南鱼（Heteroyunnan—olepis qu

本文记述了云南鱼类一新属新种－曲靖异云南鱼（Ｈｅｔｅｒｏｙｕｎｎａｎｏｌｅｐｉｓ ｑｕｊｉｎｇｅｎｓｉｓ ｇｅｎ．ｅｔ ｓｐ．ｎｏｖ．）。它与已知云南鱼类的主要区别在于：１）眶下沟通过后缘片;２）不具眶前凹槽而具眶前凹。基于对新属详细的描述和比较,对甲类中“后缘片”和“前鳃盖沟”的同源关系,眶前凹槽和眶前凹相互关系做了尝试性的探讨。