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为了获得具有高催化活性且抗反馈抑制的大肠杆菌分支酸变位酶 预苯酸脱水酶 (chorismatemutase prephenatedehydrataseCM PDT) [EC5 .4 .99.5 EC4 .2 .1.5 1],通过相关菌种CM PDT氨基酸序列同源比较 ,寻找高度保守位点 .用定点突变及PCR法构建突变酶M1(缺失 30 4T、30 5G、Q30 6K)、M2 (缺失W 338)、M3(缺失 30 1~ 386位氨基酸 )、M32 9(E32 9A)和M374 (C374A) ,野生型及各突变型基因与pET2 8a(+ )载体连接后 ,表达融合蛋白 .在非变性条件下 ,由TALON金属螯合亲和层析柱纯化野生型和突变体的酶蛋白 .酶活性测定表明 ,突变体M3的PDT活性下降为野生型活性的 2 9% ,但保持了CM活性 .突变体M374保持了CM ,PDT两种酶的活性 ,突变体M1、M2、M32 9的CM ,PDT活性有一定程度的提高 .酶抗反馈抑制作用检测表明 ,突变体M3、M374解除了苯丙氨酸的反馈抑制作用 ,M1、M2、M32 9部分解除了苯丙氨酸的反馈抑制作用 .与含野生型pheA基因的E .coliBL2 1菌株相比 ,含突变基因的E .coliBL2 1菌株对 10mmol L的苯丙氨酸代谢类似物具有强的抗反馈抑制作用 ,其中M1,M2 ,M3对 2 0mmol L的类似物具有抗反馈抑制作用 相似文献
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大肠杆菌莽草酸途径限速酶多基因盒的构建及基因替换 总被引:2,自引:0,他引:2
优化大肠杆菌芳香族氨基酸生物合成代谢途径 ,构建莽草酸代谢途径限速酶的多基因盒PtacaroAaroCaroBkan .利用Red重组系统 ,在破坏整体调控基因csrA时 ,替换多基因盒 .Southern印迹证实 ,基因破坏和基因替换是成功的 .摇瓶发酵表明 ,构建的基因工程菌株比原始菌株基础产酸率提高了 4 5 3倍 相似文献
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地衣是由共生菌与共生藻互惠共生形成的一类特异化真菌,也叫地衣型真菌。全球已知约 1.3万种。其中,绝大多数是子囊地衣,仅约 1%是由担子菌与共生藻结合形成担子地衣。担子地衣的有性繁殖是通过担子果产生担孢子,担孢子在适合的环境中与共生藻结合,形成担子地衣体。2012 年我们在滇西北野外考察中,发现了目前全球已知担子地衣中最大的子实体 ( 标本号: 王立松等 12 -34740) 。该地衣生长在海拔 3 678 m 的湿冷环境中,腐木生,地衣体群落面积 60 cm × 50 cm; 地衣体呈鳞片状,直径1 ~ 7 mm; 上表面平坦或微凹陷,暗绿色至淡黄绿色, 相似文献
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目的克隆我国资源小型猪品系巴马香猪肝脏中的CYP3A88基因,并进行生物信息学分析。方法应用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技术对其全长进行扩增,测序,利用Internet和GenBank数据库对其序列进行生物信息学分析。结果首次克隆并鉴定了我国资源小型猪品系巴马香猪肝脏中CYP3A88(GenBank登录号:EF625347)的编码区,获得大小为1965bp的全长cDNA,编码区长为1512bp,编码503个氨基酸;比较核苷酸序列,与小型猪CYP3A39相似性高达94%,而与人等其它动物的CYP3A相似性则在86%以下;推导和分析氨基酸序列表明,与小型猪CYP3A其它成员(CYP3A39、CYP3A29、CYP3A22)进行对比,其相似性分别为92%,89%,80%,而将小型猪与人的CYP3A分别比对,小型猪CYP3A88与人CYP3A4相似性最高,为77%;对其二级结构预测,它可能含12个α螺旋,4个β折叠;经NCBI上的CDD程序分析可知,其39~491氨基酸区域为P4503A亚家族保守结构区域;经聚类分析,小型猪和狗的CYP3A与人有较近的进化关系;通过同源建模法对其在线建模,人CYP3A4晶体结构作为其模建模型,得到了其经典的三维结构。结论在猪CYP3A家族四个基因中,CYP3A88在序列和高级结构上均与人CYP3A4的最为相似。 相似文献
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ppsA和tktA是芳香族氨基酸生物合成中心途径的两个关键酶基因,在大肠杆菌中,ppsA基因编码磷酸烯醇式丙酮酸合成酶A(PpsA),该酶催化丙酮酸合成磷酸烯醇式丙酮酸;tktA基因编码转酮酶A,该酶在磷酸戊糖途径中生成4-磷酸赤藓糖起主要作用。采用PCR方法从大肠杆菌K-12株中扩增到ppsA和tktA,并实现了两基因的高效表达,其中ppsA活性提高了10.8倍,tktA活性提高了3.9倍,当这两个基因串联在一个质粒上导入大肠杆菌进行表达时,PpsA的活性变化较大(2.1~9.1倍),TktA的活性相对稳定(3.9~4.5倍),且这两个基因单独表达和串联表达都能使芳香族氨基酸生物合成共同途径中关键中间产物DAHP的产量提高,且串联表达比单独表达较高。 相似文献
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视黄醇结合蛋白L35和Q98位点突变及其对与视黄醇结合的影响 总被引:1,自引:0,他引:1
根据视黄醇结合蛋白 (RBP)晶体结构和计算机模拟对拟突变位点所作出的结构预测 ,筛选出 2个可能对RBP结合能力有影响的氨基酸位点 .利用定点突变技术分别将 35位亮氨酸突变为能引入较大构象变化的甘氨酸 ,将 98位谷氨酰胺突变为亲水、带正电的精氨酸 .将突变后的RBP基因转入表达宿主菌获得表达后 ,对突变体蛋白实现了变性条件下的分离纯化 .复性后与视黄醇的荧光增强饱和滴定试验表明 ,35位突变为甘氨酸后对RBP结合能力没有产生明显的影响 ,但 98位突变为精氨酸后 ,则显著的提高了与视黄醇的结合能力 ,说明 98位是影响RBP与视黄醇结合和解离的重要位点 . 相似文献
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CRISPR/Cas技术是一项新兴的基因编辑技术,它利用与目标序列互补的向导RNA(sg RNA)引导Cas酶定点切割DNA。由于该技术操作简便、要求低,已成为近几年最受关注的基因编辑技术。而随着该技术的广泛使用和人们对CRISPR/Cas系统了解的不断深入,对该技术优与劣的争论也不断升温。本文就该技术的起源、CRISPR/Cas系统的工作原理,以及目前的主流应用和成果进行了介绍,希望能够帮助人们对CRISPR/Cas技术有一个更全面的了解。 相似文献
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大肠杆菌ppsA和tktA基因的串联表达 总被引:5,自引:0,他引:5
ppsA和tktA是芳香族氨基酸生物合成中心途径的两个关键酶基因,在大肠杆菌中,ppsA基因编码磷酸烯醇式丙酮酸合成酶A(PpsA),该酶催化丙酮酸合成磷酸烯醇式丙酮酸;tktA基因编码转酮酶A,该酶在磷酸戊糖途径中生成4-磷酸赤藓糖起主要作用。采用PCR方法从大肠杆菌K-12株中扩增到ppsA和tktA,并实现了两基因的高效表达,其中ppsA活性提高了10.8倍,tktA活性提高了3.9倍,当这两个基因串联在一个质粒上导入大肠杆菌进行表达时,PpsA的活性变化较大(2.1~9.1倍),TktA的活性相对稳定(3.9~4.5倍),且这两个基因单独表达和串联表达都能使芳香族氨基酸生物合成共同途径中关键中间产物DAHP的产量提高,且串联表达比单独表达较高。 相似文献
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视黄醇结合蛋白研究 总被引:3,自引:0,他引:3
人视黄醇结合蛋白 (retinolbindingpro tein ,RBP)由 1 84个氨基酸组成 ,分子量 2 1kd ,是单链、疏水小分子结合蛋白 ,属于脂肪酸结合蛋白家族成员。RBP在肝脏中合成 ,释放入血后与视黄醇 (ROH)、甲状腺素运载蛋白(TTR)以 1∶1∶1的比例形成三元复合物 ,是体内运送视黄醇至其特定靶组织的运载蛋白[1] 。RBP的mRNA在肝中的含量最高。RBP只有受到视黄醇的刺激才分泌 ,视黄醇的缺乏会阻断细胞内合成的RBP由内质网到高尔基体的转运 ,从而影响RBP的分泌 ,而且分泌入血的RBP量也受到视黄醇… 相似文献