汉滩病毒核蛋白羧基端多肽原核表达载体的构建及表达

本文为建立分型检测方法,探讨了汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)核蛋白羧基端多肽的抗原性。首先,分别构建编码HTNV核蛋白及其羧基端多肽的原核表达载体pRSETA—S、pRSETA—S—C;然后,将其转化入表达菌BL21(DE3)pLySs诱导表达,采用SDS—PAGE、Westem—blot进行鉴定。我们成功构建了pRSET A—S及pRSETA—S—C原核表达载体。SDS-PAGE显示目的蛋白大量表达,呈不溶状态,Westem—blot显现目的蛋白具有良好的抗原性。为大量制备分型用核蛋白多肽抗原创造了条件。     

华北三代粘虫大发生虫源的形成

【目的】我国3代粘虫的种群构成还少有研究,华北3代粘虫的虫源问题也不清楚。为此,需厘清3代粘虫发生区的风场动态和迁出种群的去向,为明确各地的虫源关系提供依据。【方法】根据国家气象局的高空气象记录,分析高空风场;利用HYSPLIT平台模拟华北粘虫夏季迁出种群的迁飞轨迹和落点分布。【结果】在夏季风盛行的背景下,3代粘虫主要来自于与其发生区相邻的偏南地区(约占45%),如鲁东、苏皖鄂、浙北、赣北、湘北等;另一个主要来源是西北区(包括晋陕甘宁,约占10%)和华北北部(内蒙古及以北区域,约占7%);在某些年份,西南地区也会提供约6%的虫源。另外,还有约30%的虫源来自于发生区域内的相邻地方,属于当地前代滞留虫源的近距离迁飞;而东北区对华北3代粘虫的虫源构成则只有极微的贡献(约0.2%)。从山西和陕西起飞的1代成虫则主要是北迁,有将近30%的个体迁入了华北3代粘虫发生区,约23%迁入内蒙古及以北地区,还有约4%迁入西北的甘肃宁夏、约5%迁入东北区,另有27.5%的个体近距离迁飞落在本省境内。晋陕种群南向迁飞的比率不大,只有大约10%的个体迁入3代粘虫发生区的南邻区域。【结论】华北3代粘虫的暴发属于小概率事件,如此大范围的潜在虫源和如此局部的发生区,以及复杂的天气系统给我国华北地区3代粘虫的预测预警工作造成了极大的困难,需要研究部门与推广部门通力合作,做更多的实证研究和个例分析,逐渐深化对3代粘虫暴发机制的认识。     

汉滩病毒核蛋白羧基端多肽原核表达载体的构建及表达

本文为建立分型检测方法,探讨了汉滩病毒(Hantaan virus, HTNV)核蛋白羧基端多肽的抗原性.首先,分别构建编码HTNV核蛋白及其羧基端多肽的原核表达载体pRSET A-S、pRSET A-S-C;然后,将其转化入表达菌BL21(DE3)pLySs诱导表达,采用SDS-PAGE、Western-blot进行鉴定.我们成功构建了pRSET A-S及pRSET A-S-C原核表达载体.SDS-PAGE显示目的蛋白大量表达,呈不溶状态,Western-blot显现目的蛋白具有良好的抗原性.为大量制备分型用核蛋白多肽抗原创造了条件.     

东北迁飞场对粘虫的Pied piper效应

【目的】我国2代粘虫的回迁过程和3代粘虫的种群构成还少有研究,东北与华北3代粘虫的虫源问题也不清楚。为此,需厘清2代粘虫发生区的风场动态和迁出种群的去向,明确东北粘虫夏季迁出种群与华北3代粘虫的虫源关系。【方法】根据国家气象信息中心的高空气象记录,统计东北和华北地区夏季各方位风向的频次和平均出现频率,利用HYSPLIT平台模拟东北粘虫夏季迁出种群的迁飞轨迹和落点分布。【结果】东北和华北地区7、8月的风向均以西南、南风为主且因气旋频繁过境而风向多变,不利于东北粘虫夏季种群回迁进入华北农作区;而对其迁出种群的轨迹模拟结果也表明,东北粘虫夏季种群能够进入华北的可能性极低:它们或迁入更北的无法生存的山区,或未能成功跨海而死亡,抑或迁入朝鲜半岛成为当地的虫源(同样无法越冬),还有一部分滞留东北地区继续为害一代后因气候原因死亡,而只有在极少数风向风速条件适宜的情况下才有可能进入河北。【结论】东北地区的夏季风场不利于东北粘虫的回迁,华北3代粘虫的种群构成与东北夏季种群几无关系,东北迁飞场表现出显著的Pied piper效应。     

汉坦病毒结构蛋白抗原表位的研究进展

汉坦病毒结构蛋白抗原表位的研究对于阐明该病毒结构蛋白的结构与功能及其基因工程疫苗研制至关重要,本文综述了近年来汉坦病毒抗原表位研究中应用的各种生物新技术以及汉坦病毒结构蛋白B细胞表位和T细胞表位的最新进展。     

胡黄连苷Ⅱ通过抑制NF-κB/MAPK信号通路减轻过敏性哮喘大鼠炎症反应

摘要 目的：探究胡黄连苷Ⅱ对过敏性哮喘大鼠炎症反应以及NF-κB/MAPK信号通路的影响。方法：采用卵清白蛋白致敏和雾化吸入激发构建过敏性哮喘大鼠模型。将建模成功的大鼠随机分为模型组、胡黄连苷Ⅱ组和C16-PAF组,另取未建模健康的大鼠作为对照组,每组8只。胡黄连苷Ⅱ组大鼠在造模成功后每日给予灌胃剂量为80 mg/kg的胡黄连苷Ⅱ,激活剂组（C16-PAF组）大鼠每日给予灌胃剂量为80 mg/kg的胡黄连苷Ⅱ和50 μL浓度为4 μmol/L的C16-PAF溶液（MAPK激活剂）,共给药14天。模型组大鼠同时给予灌胃等量的生理盐水,对照组大鼠分别在造模和给药同期给予腹腔注射、雾化吸入和灌胃等量的生理盐水。采用全身体积描记法记录大鼠肺功能指标FVC、PEF、FEV0.3以及FEV0.3/FVC。通过苏木精-伊红（HE）染色检测大鼠肺组织病理学变化。采用瑞氏染色分析大鼠肺泡灌洗液（BALF）中白细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞计数。采用ELISA法检测大鼠血清中OVA-IgE和ET-1水平和BALF中炎性因子IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ水平。采用免疫组织化学染色法分析大鼠肺组织中p-p38MAPK和p-NF-κBp65表达水平。采用Western blot检测大鼠肺组织NF-κB/MAPK信号通路相关蛋白表达水平。结果：对照组大鼠肺组织基本结构和形态均正常,未见炎性细胞浸润和组织病变;模型组大鼠肺组织出现明显的炎性细胞浸润,支气管腔壁显著增厚、管腔缩小,肺泡壁增厚且破坏严重;胡黄连苷Ⅱ组大鼠肺组织炎性细胞浸润、肺泡和支气管结构损伤改善明显;C16-PAF组大鼠肺组织出现与模型组大鼠类似的组织损伤情况,但严重程度稍微降低。与对照组比较,模型组大鼠的FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC和PEF值均降低（P<0.05）,BALF中淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、白细胞计数、IL-4、IL-5和IL-13均升高（P<0.05）,BALF中IFN-γ水平降低（P<0.05）,血清中IgE和ET-1水平均升高（P<0.05）,肺组织中p-NF-κBp65和p-p38MAPK蛋白表达水平均升高（P<0.05）。与模型组比较,胡黄连苷Ⅱ组大鼠的FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC和PEF值均升高（P<0.05）,BALF中淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、白细胞计数、IL-4、IL-5和IL-13均降低（P<0.05）,BALF中IFN-γ水平升高（P<0.05）,血清中IgE和ET-1水平均降低（P<0.05）,肺组织中p-NF-κBp65和p-p38MAPK蛋白表达均降低（P<0.05）;与胡黄连苷Ⅱ组比较,C16-PAF组大鼠的FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC和PEF值均降低（P<0.05）,BALF中淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、白细胞计数、IL-4、IL-5和IL-13均升高（P<0.05）,BALF中IFN-γ水平降低（P<0.05）,血清中IgE和ET-1水平均升高（P<0.05）,肺组织中p-NF-κBp65和p-p38MAPK蛋白表达水平均升高（P<0.05）。与模型组大鼠比较,C16-PAF组大鼠的各项指标差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：胡黄连苷Ⅱ可能通过抑制NF-κB/MAPK信号通路减轻过敏性哮喘大鼠炎症反应进程。     

三七连作土壤浸提液对其根腐病菌的化感效应

采用甲醇、乙酸乙酯和水分别按液土比3∶1、6∶1和9∶1对三七连作土壤进行浸提,研究其浸提液对三七根腐病菌生长和种群数量的影响。结果表明: 平板培养72 h后,甲醇、乙酸乙酯和水浸提液对尖镰孢菌和腐皮镰孢菌的菌丝生长均表现为化感促进,其中,甲醇和乙酸乙酯浸提液对尖镰孢菌的化感效应指数为14.0%～19.8%和16.2%～20.2%,高于水浸提液的8.9%～14.2%,且不同浸提比例之间差异不显著;而甲醇浸提液对链格孢菌菌丝生长表现为化感抑制,且抑制效应在浸提比例为3∶1时最强,达到-33.2%～-38.5%,乙酸乙酯和水浸提液对链格孢菌菌丝生长无显著影响。土壤培养4周后,甲醇、乙酸乙酯和水浸提液均能增加土壤中尖镰孢菌的数量,其中,水浸提液的增加效应最强,达到每克干土3.49×10⁶～9.56×10⁶拷贝数,高于甲醇(每克干土1.68×10⁴～6.73×10⁴拷贝数)和乙酸乙酯浸提液(每克干土1.77×10⁴～3.72×10⁴拷贝数),且这种增加效应随浸提比例的增加逐渐减弱;水浸提液和低浸提比例的甲醇提取液均能增加土壤中腐皮镰孢菌的数量,而重茬土壤浸提液对链格孢菌的数量影响不显著。因此,三七连作土壤浸提液对根腐病菌如尖镰孢菌和腐皮镰孢菌均表现出明显的化感促进效应,这可能是再植三七易发生根腐病等土传病害的原因之一。     

汉滩病毒S基因及其5‘端真核表达载体的构建及在细胞中的表达

体外研究汉滩病毒（ＨＴＮＶ）Ｓ基因及其５'端表达的意义,为核蛋　白Ｔ细胞表位的研究奠定基础。设计２套引物,用ＰＣＲ方法从ＰＢＶ２２０－Ｓ２２原核质粒中扩增出Ｓ　基因全读码框（３７－１３２６ｂｐ）及Ｓ基因５'端（３７－５０１ｂｐ）,用ＴＡ克隆将其克隆入ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５－Ｈｉｓ－ＴＯＰＯ载体中,成功构建ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ及ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ－Ｎ真核表达载体,并通过脂质体转　染至Ｖｅｒｏ细胞中,进行了瞬时表达。间接免疫荧光成功检测到ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ及ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ－Ｎ在Ｖｅｒｏ细胞中的表达。ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ及ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ－Ｎ真核表达载体有较高的转染效率,目　的基因能在宿主细胞中表达,有利于研究ＨＴＮＶ－Ｓ基因在Ｔ细胞表位研究中的意义。     

汉滩病毒S基因及其5'端真核表达载体的构建及在细胞中的表达

体外研究汉滩病毒(HTNV)S基因及其5'端表达的意义,为核蛋白T细胞表位的研究奠定基础.设计2套引物,用PCR方法从PBV220-S22原核质粒中扩增出S基因全读码框(37-1326bp)及S基因5'端(37-501bp),用TA克隆将其克隆入pcDNA3.1/V5-His-TOPO载体中,成功构建pcDNA3.1-S及pcDNA3.1-S-N真核表达载体,并通过脂质体转染至Vero细胞中,进行了瞬时表达.间接免疫荧光成功检测到pcDNA3.1-S及pcDNA3.1-S-N在Vero细胞中的表达.pcDNA3.1-S及pcDNA3.1-S-N真核表达载体有较高的转染效率,目的基因能在宿主细胞中表达,有利于研究HTNV-S基因在T细胞表位研究中的意义.     

从HFRS患者的PBMC建立BLCL及其意义

体外研究汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)S基因及其5'端、3'端在BLCL(EBV-transformed Blymphoblastoidcellline,BLCL)内稳定表达的意义,为核蛋白T细胞表位的研究奠定基础.本研究从肾综合征出血热(HFRS)患者的外周血单个核细胞(PBMC)建立与HTNV特异性CTL同源的患者自身的EB病毒转化的B淋巴母细胞系,将含有不同HTNV S基因片段的重组真核表达载体转染入BLCL,获得长期稳定表达,作为靶细胞系,为下一步进行CTL杀伤试验提供靶细胞系.设计4条引物,用PCR方法从PBV220-S22原核质粒中扩增出S基因全读码框(37-1326bp)及S基因5'端(37-501bp),S基因3'端(502-1326bp),用TA克隆将其克隆入pcDNA3.1/V5-His-TOPO载体中,成功构建pcDNA3.1-S及pcDNA3.1-S-N、pcDNA3.1-S-C真核表达载体,并通过脂质体转染至BLCL细胞中,进行了稳定表达.间接免疫荧光成功检测到pcDNA3.1-S及pcDNA3.1-S-N、pcDNA3.1-S-C在BLCL细胞中的表达.pcDNA3.1-S及pcDNA3.1-S-N、pcDNA3.1-S-C真核表达载体有较高的转染效率,目的基因能在宿主细胞中长期稳定表达,有利于研究HTNV-S基因在T细胞表位研究中的意义.建立的特异性CTL克隆对表达完整NP、NP羧基和氨基端肽段的靶细胞均有比较明显的杀伤效应,平均杀伤率分别为50.2%、39.0%和25.4%.HTNV-NP优势T细胞表位可能主要位于病毒核蛋白的羧基端.