重组hKGF2原核表达载体的构建及其蛋白质的纯化

角质细胞生长因子2（ keratinocyte growth factor 2, KGF2）是新近发现且发展迅速的成纤维细胞生长因子家族中新的一员,又称FGF10,是上皮细胞特异性的促有丝分裂剂,应用前景广泛。为构建其高效原核表达菌株,首先用RT-PCR法从培养的人胚胎肺成纤维细胞中获得去除信号肽的hKGF2 cDNA,将其插入pMD18-T载体;经测序后,克隆入pET-30a( + )表达载体,将成功构建的pET-30a( + )- hKGF2重组表达载体转入大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达后, SDS-PAGE及Western blot鉴定重组蛋白为高效可溶性表达。重组蛋白经Ni+-NTA（镍亲和层析）一步法纯化后纯度达95%以上,为进一步的应用研究及大规模生产奠定了基础。     

一种用矽石快速提取总RNA的方法

根据矽石能与核酸结合的特性,建立了用矽石提取细胞和组织总RNA的方法,方法简便、快速,所得RNA适用于各种研究。     

人角质细胞生长因子2基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:构建人角质细胞生长因子2(hKGF2)基因的高效原核表达载体pET-30a( )-hKGF2,并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得表达。方法:从培养的人胚胎肺成纤维细胞中提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增出去除了信号肽部分的hKGF2基因,克隆到pMD18-T载体,经DNA序列分析后与pET-30a( )表达载体连接,在大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达6×His-hKGF2,用SDS-PAGE及Western印迹鉴定表达蛋白。结果:构建了表达载体pET-30a( )-hKGF2,经IPTG诱导后,表达的重组蛋白理论相对分子质量约为23000,约占菌体总蛋白的20%。结论:6×His-hKGF2蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中为可溶性高效表达,为获得高纯度、高活性的产物,以及进一步的大规模生产和应用研究奠定了基础。     

人Leptin的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

用 RT- PCR自脂肪细胞 RNA扩增人瘦素 (leptin)基因的 c DNA片段 (约 50 0 bp)并克隆至克隆载体 p SK(+) ,获得重组质粒 p SK- OB,DNA序列分析显示获得的 Leptin基因和文献报道一致 .用限制酶 Eco R 和 Bam H 从 p SK- OB切下并插入原核表达载体 p BV2 2 0的相应限制酶位点 ,转化大肠杆菌 DH5α.转化菌株经 42℃诱导 ,SDS- PAGE检测和 Western印迹鉴定 ,获得高水平重组人瘦素的表达菌株 ,其表达量达菌体总蛋白的 30 %以上 .