HPLC法检测蛇足石杉内生真菌胶胞炭疽发酵液中石杉碱甲和石杉碱乙的含量

建立了高效液相色谱(HPLC)测定蛇足石杉(Huperzia serrate)内生真菌胶胞炭疽发酵液中石杉碱甲(Huperzina A)和石杉碱乙(Huperzine B)含量的方法,并以此方法检测胶胞炭疽发酵液中石杉碱甲和石杉碱乙含量的积累。内生真菌发酵液经氯仿萃取、甲醇溶解、过滤后进行高效液相检测分析,选用Agilent Eclipse plus-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以0.015 mol/L乙酸铵(p H 6.8)和甲醇溶液(70∶30)为流动相进行等度洗脱,流速1 mL/min,检测波长为308 nm,连续检测内生真菌胶胞炭疽发酵液中第6–15天石杉碱甲和石杉碱乙的含量积累。结果表明,发酵提取液中的石杉碱甲和石杉碱乙可在25 min内进行很好的分离和分析,石杉碱甲在1.50-48.00μg/mL范围内线性关系良好(相关系数r为0.999 5),石杉碱乙在0.25-7.50μg/mL范围内线性关系良好(相关系数r为0.999 7),石杉碱甲和石杉碱乙的平均加标回收率分别为106.83%、108.06%,相对标准偏差(RSD)分别为3.34%、3.60%。该方法简便、快速、精密度高、结果准确,适用于内生真菌发酵液中石杉碱甲和石杉碱乙含量检测。在发酵过程中,内生真菌发酵液中石杉碱甲和石杉碱乙的含量呈现先增后减,随后有所增加继而又减少的趋势。石杉碱甲和石杉碱乙的含量分别在内生真菌发酵第14天、第8天达到最高,分别为12.417 0μg/mL、4.660 3μg/mL。该方法学的建立为内生真菌胶胞炭疽合成石杉碱甲与石杉碱乙的机制研究提供了检测手段,从而有利于药物新资源的开发。     

组蛋白甲基化与去乙酰化对蛇足石杉内生真菌盘长孢状刺盘孢合成石杉碱甲的影响

以蛇足石杉Huperzia serrata内生真菌盘长孢状刺盘孢Cg01菌株为研究对象,利用PEG介导的同源重组转化体系,对Cg01组蛋白甲基化酶基因（histone methyltransferases,HMT）CgClr4和组蛋白去乙酰化酶基因（histone deacetylase,HDAC）CgClr3、CgSir2进行基因敲除与回补,并通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测了回补株中对应基因表达量以及高效液相色谱HPLC检测突变体菌株中石杉碱甲huperzine A（HupA）产量。结果显示3个基因敲除突变体菌株ΔCgClr4、ΔCgClr3、ΔCgSir2的HupA产量分别为255μg/L、270μg/L、244μg/L,与野生型菌株相比分别下降了21.3%、16.6%、24.7%。在基因回补突变体菌株ΔCgClr4/CgClr4、ΔCgClr3/CgClr3、ΔCgSir2/CgSir2中,相应回补基因表达均与野生型无显著性差异,其HupA产量分别为351.9μg/L、334.7μg/L、331μg/L,回补菌株的HupA产量回复到野生型水平。结果表明这3个基因均具有调控内生真菌盘长孢状刺盘孢Cg01合成HupA的作用,为研究蛇足石杉内生真菌中石杉碱甲的合成调控机制提供了理论基础和新的思路。