两个对浓核病毒(镇江株)具感性差异的家蚕品种的血液和围食膜蛋白的比较

家蚕品种间对浓核病毒(镇江株)具有不同的感染性,为了进一步探明家蚕对浓核病毒(镇江株)感性差异的分子机制,本文运用蛋白质电泳和质谱技术比较分析了两个对家蚕浓核病毒(镇江株)感性和抗性的近等基因系家蚕品种JS和NIL的血液和围食膜组织蛋白.结果表明:这两个家蚕品种的血液和围食膜组织蛋白组成差异很小.在血液组织蛋白中发现5个差异蛋白点,其中家蚕品种JS血液中有两个差异蛋白,可能分别为酪蛋白激酶和新型组织蛋白;在NIL血液组织中发现3个差异蛋白点,其中两个可能分别为线粒体延伸因子和类丝氨酸蛋白酶,另外1个的含量极显著高于JS,为血淋巴蛋白.在围食膜蛋白中共发现4个差异蛋白点,其中JS围食膜中有1个差异蛋白可能为新型组织蛋白;其余3个蛋白点在含量上相互间存在显著差异.本研究根据组织差异蛋白的功能初步推测家蚕对浓核病毒(镇江株)感性差异与血液蛋白差异无显著相关,与围食膜蛋白差异可能有关.     

基于ISSR标记的黄河下游区域鲁桑地方品种遗传关系分析

应用ISSR分子标记技术对来自黄河下游区域(山东省和河北省)的46个鲁桑[Morus alba var. multicaulis (Perrott. ) Loud. ]地方品种的遗传多样性进行了分析;并基于遗传相似系数、采用UPGMA法对这些地方品种的遗传关系进行了研究.结果表明,用15个ISSR引物从46个鲁桑地方品种的总DNA中共扩增出109条带,其中多态性条带81条,多态性条带百分率为74.31%,表明供试的鲁桑地方品种间存在丰富的遗传多样性;46个地方品种间的遗传相似系数为0.602～0.898,相对偏高.聚类分析结果显示,46个鲁桑地方品种被分为2类,其中,第1类包含来自河北的品种'冀丰'和'冀黄鲁选',第2类包含其余44个品种;后者还能进一步分成9个亚类,其中A、E、F、G、H和I亚类所包含的36个品种均来自山东,组成B、C和D亚类的品种分别来自河北和山东;此外,E亚类仅包含'白条擗桑'1个品种,是46个品种中惟一的三倍体品种.研究结果显示,基于ISSR标记分析的46个鲁桑地方品种的遗传关系与地理分布具有一定的相关性.     

二化性家蚕滞育、非滞育和即时浸酸卵中糖代谢相关酶mRNA水平和活性的变化

【目的】探究家蚕Bombyx mori胚胎发育早期卵内糖代谢与滞育的关系。【方法】以家蚕二化性品种"秋丰"活化越年卵为材料,一部分于17℃暗催青,孵化后常规饲养,制备非滞育命运卵(ND);另一部分于25℃明催青,孵化后常规饲养,制备滞育命运卵(DD),再用盐酸溶液处理部分DD卵制备即时浸酸卵(IA)。在卵产下或浸酸后0, 2, 6, 12, 24, 48, 72和96 h分别取样,利用qRT-PCR测定家蚕卵中己糖激酶(hexokinase, HK)、磷酸果糖激酶(phosphofructokinase, PFK)、山梨醇脱氢酶(sorbitol dehydrogenase, SDH)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK)和海藻糖酶(trehalase, TRE)5种糖代谢相关酶基因的mRNA表达水平,利用紫外-可见分光光度法测定家蚕卵中这5种酶的活性。【结果】家蚕糖酵解途径关键酶己糖激酶(BmHK)和磷酸果糖激酶(BmPFK),以及糖分解代谢关键酶山梨醇脱氢酶(BmSDH-1)和海藻糖酶(BmTRE)在ND和IA中...     

浓核病毒感染早期家蚕血液、中肠蛋白表达差异比较分析

为了探明在浓核病毒镇江株(BmDNV-ZJ)侵染早期,家蚕部分组织蛋白所产生的免疫抵抗性变化机制,本实验采用差异蛋白质组学技术研究分析了BmDNV-ZJ感染早期,家蚕的中肠、血液组织中特异性表达的差异蛋白.实验结果表明:在浓核病毒侵染初期,感受性家蚕的中肠组织受病毒感染而得到特异性表达的蛋白可能为丝氨酸蛋白酶抑制剂和巯基抗氧化酶蛋白,前者具有调控蛋白酶活性和细胞凋亡的功能,后者具有抗氧化的作用.血液组织受病毒感染诱导而产生的蛋白可能是丝裂原活化蛋白激酶和类抗氧化酶蛋白,前者具有调控细胞凋亡的功能,后者具有抗氧化、消除自由基作用.由于试验中所得的差异蛋白点很少,这表明在BmDNV-ZJ感染早期,蚕体对浓核病毒的感染而产生的反应很小.蚕体可通过被侵染的中肠组织(浓核病毒感染的靶部位)以及血液(免疫组织)共同产生一些抗氧化或调控细胞凋亡的酶蛋白等来抗击浓核病毒的侵染.     

天宫二号航天蚕后代小茧突变体sc的发现与基因定位

【目的】从2016年天宫二号空间实验室经历33 d后返回的1头成活“秋丰×白玉”杂交后代雌蚕Bombyx mori与地面“白玉”雄蚕交配的后代个体中,发现有结小茧突变体,进而分离并建立了飞天蚕(space silkworm)正常茧品系TG和小茧突变体品系sc。本研究通过对sc进行遗传分析和基因定位,旨在揭示产生小茧突变体的基因。【方法】对TG和sc进行表型分析;以sc, TG和正常大茧品系0223V1为试验材料,组配(sc♀×0223V1♂)F₁及回交群体BC₁F——(sc♀×0223V1♂)F₁♀×sc♂和BC₁M——sc♀×(sc♀×0223V1♂)F₁♂。以sc, 0223V1和F₁基因组DNA为模板,每个连锁群随机选10个SSR引物进行PCR扩增,筛选多态性SSR标记。利用雌性家蚕减数分裂染色体不交换的特点,用BC₁F确定sc基因所属连锁群;再根据家蚕SSR分子标记连锁图谱,用BC1M进行基因定位。【结果】表型分析表明sc幼虫体型小于TG幼虫的,蚕茧重约为TG的1/2。遗传分析表明突变受一对隐性基因sc控制;基因定位结果表明该基因位于家蚕基因组第3连锁群S2930-363和S2930-289 SSR标记之间,物理距离为684 kb,包含33个候选基因。【结论】飞天蚕小茧突变受位于家蚕基因组第3连锁群的一对隐性基因sc控制。     

家蚕滞育关联山梨醇脱氢酶基因的启动子活性分析

【目的】明确家蚕Bombyx mori滞育关联基因山梨醇脱氢酶基因BmSDH(BmSDH-1,BmSDH-2a和BmSDH-2b)的转录特性。【方法】用5'RACE技术确定家蚕3个BmSDH基因的转录起始位点。利用PCR技术克隆3个BmSDH基因约1 kb及BmSDH-2a不同长度的启动子区序列,分别构建带有萤火虫荧光素酶报告基因的载体pGL3-BmSDH-P-luc,并与pRL-CMV报告质粒(含海肾荧光素酶报告基因)共转染家蚕BmN细胞,通过双荧光素酶检测系统检测BmSDH基因启动子活性;分别在BmN细胞培养基中添加昆虫保幼激素、蜕皮激素和滞育激素,通过双荧光素酶检测系统检测不同浓度激素处理对BmSDH-2a基因启动子活性的影响。【结果】BmSDH-1的转录起始位点为A(-41),BmSDH-2a的转录起始位点为C(-41),BmSDH-2b的转录起始位点为A(-40)(翻译起始位点为+1)。双荧光素酶检测结果表明,BmSDH-2a启动子活性极显著高于BmSDH-1和BmSDH-2b启动子,BmSDH-2a 355 bp长度片段的启动子活性极显著高于674 bp和1 117 bp长度片段。用不同浓度滞育激素处理BmN细胞后,BmSDH-2a的1 117 bp启动子活性随着滞育激素浓度的升高有上升的趋势,当浓度高于100 ng/mL时启动子活性有所降低但仍保持在较高水平;用保幼激素进行处理后,随着激素浓度的升高启动子活性逐渐降低;蜕皮激素处理后,0.1 ng/mL激素显著增强启动子活性,当激素浓度继续升高启动子活性逐渐降低。【结论】确定了BmSDH基因的转录起始位点。BmSDH-2a启动子活性显著高于BmSDH-1和BmSDH-2b启动子,一定浓度的蜕皮激素能显著提高BmSDH-2a启动子活性。研究结果有助于阐明BmSDH基因在家蚕滞育中的功能。     

Bmo-miR-375-3p对家蚕丝素蛋白轻链基因BmFib-L表达的调控作用

【目的】探究家蚕Bombyx mori miRNAs对丝素蛋白轻链基因(fibroin light chain gene,Bm FibL)和P25蛋白基因Bm P25表达的调控作用。【方法】分别以Bm Fib-L和Bm P25 mRNA 3'UTR为靶序列,应用在线预测软件RNAhybrid从前期家蚕4和5龄幼虫后部丝腺(posterior silk gland)sRNA高通量测序获得的29个差异表达bmo-miRNAs中,筛选对Bm Fib-L和Bm P25具有调控作用的候选bmo-miRNAs;采用半定量RT-PCR方法在mRNA水平分析候选bmo-miRNAs及其靶基因Bm Fib-L和Bm P25在4和5龄幼虫期以及5龄第3天幼虫不同组织的表达水平;利用双荧光报告基因检测系统在家蚕细胞Bm N中验证候选bmo-miRNAs对Bm Fib-L和Bm P25表达的调控作用。【结果】筛选到一个在Bm Fib-L和Bm P25 mRNA 3'UTR上都有靶位点的bmo-miR-375-3p(曾称bmo-miR-375*)。在后部丝腺中bmo-miR-375-3p和其预测靶基因Bm Fib-L和Bm P25都有较高的表达水平,提示bmo-miR-375-3p具备调控Bm Fib-L和Bm P25表达的时空条件。miR-375-3p重组表达载体与融合了Bm Fib-L 3'UTR的萤火虫荧光素酶(luciferase)报告基因(luc)表达载体共转染Bm N细胞,报告基因luc的表达水平显著下降;而在miR-375-3p重组表达载体与融合了Bm P25 3'UTR的luc表达载体共转染Bm N细胞中报告基因luc的表达水平下降不显著。【结论】miR-375-3p显著下调Bm Fib-L基因的表达,而对Bm P25基因的表达无明显调控作用。     

SARS-CoV-2中和性纳米抗体的原核表达及中和活性检测

纳米抗体(nanobody,Nb)作为目前已知的能与目标抗原结合的最小单位抗体,在生物医药、临床研究等方面具有良好的应用前景。根据大肠杆菌密码子偏好性优化合成严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2,SARS-CoV-2)中和性纳米抗体H11-D4基因,将其克隆到pET28a表达载体上后,转化至大肠杆菌感受态细胞Rosetta(DE3)进行诱导表达,通过镍柱纯化、质谱分析、Western Blot鉴定H11-D4的表达情况并使用中和试验验证其中和活性。研究结果显示,纳米抗体H11-D4可成功在大肠杆菌中表达,最佳诱导条件为IPTG终浓度1.0 mmol·L^-1,37℃诱导5 h。H11-D4抗体的分子量大小约为17.9 kD,与预测值相符。经镍柱纯化后,产量为25.16 mg·L^-1。透析复性后利用TritonX-114快速有效地去除了内毒素,中和试验成功验证了H11-D4的中和活性(IC50)为171.1 nmol·L^-1,研究结果可为...     

m~6A修饰及其对病毒复制过程调控研究进展

N6-甲基腺嘌呤(N~6-methyladenosine, m~6A)修饰是一种在真核生物中普遍存在的RNA修饰方式,在mRNA转运、稳定、翻译等过程中具有重要作用。m~6A修饰在病毒复制周期中扮演不同的角色,病毒的复制和宿主对病毒的免疫反应都受到m~6A甲基化的影响。本文总结了近年来关于m6A修饰方面的分子作用机制及其对病毒复制以及宿主免疫反应的影响相关研究,以期为病毒生命周期中的表观遗传调控研究提供一定的参考。     

家蚕两种新的类鹑斑突变体的遗传分析和SSR标记定位

在家蚕品种选育过程中发现了两种斑纹突变体, 与普通斑相比, 其幼虫眼状纹不明显, 而半月纹和星状纹正常, 其间有点和线构成鹑状斑纹, 第6、7腹节背面布有纵向波纹状斑纹, 整体斑纹与鹑斑(quail,q)极其相似, 暂且命名为类鹑斑(quail-like, q-l)。其中一种突变体稚蚕期体色呈褐色, 蚕体发育正常, 蚕茧大小一致, 茧型正常, 称为褐色类鹑斑(brown quail-like, q-lb); 另一种突变体幼虫体色为浅粉紫色, 幼虫食桑量少, 发育缓慢, 体质较弱, 体型较小, 茧型偏小, 称为紫色类鹑斑(purple quail-like, q-lp)。遗传分析表明, 两个类鹑斑基因均为隐性基因; 褐色类鹑斑(q-lb)与紫色类鹑斑(q-lp) 为等位基因, 紫色类鹑斑(q-lp)对褐色类鹑斑(q-lb)为隐性。经与形态标记P3(2)、p(2)、Ze(3)、L(4)、re(5)、E(6)、q(7)、I-a(9)、ms(12)、ch(13)、oa(14)、cts(16)、mln(18)、 msn(19)、rb(21)、so(26)测验和SSR分子标记多态性分析, 新发现的两种类鹑斑不同于鹑斑(q), 其基因座位于第8连锁群。