阿卡波糖生物合成调控蛋白的钓取与功能解析

[目的] 发现游动放线菌Actinoplanes sp.SE50/110中阿卡波糖生物合成的调控因子,并提高其产量。[方法] 首先,利用DNA亲和层析技术,钓取与阿卡波糖生物合成基因簇2个双向启动子区域结合的调控蛋白。然后,在阿卡波糖产生菌QQ-2中强化表达或敲除这些调控蛋白编码基因,进行体内功能验证。同时,利用大肠杆菌BL21（DE3）异源表达获得可溶性蛋白,通过凝胶阻滞实验验证蛋白与启动子区域的结合能力。[结果] 经DNA亲和层析及蛋白质质谱分析,钓取出9个与双向启动子P_WV和P_AB结合的调控蛋白。在QQ-2中分别强化表达和缺失这9个调控基因后发现,基因ACPL_1889的强化表达使阿卡波糖产量提高25%,而该基因的缺失使产量降低22%;基因ACPL_5445、ACPL_3989的强化表达使阿卡波糖产量分别降低12%和39%,而这两个基因的缺失使产量分别提高15%和8%。对阿卡波糖生物合成基因转录水平的检测发现,强化表达基因ACPL_1889使acbA、acbB、acbW、acbV的转录水平升高,而缺失该基因使这4个基因的转录水平降低;敲除基因ACPL_5445使这4个基因转录水平均有提高;强化表达基因ACPL_3989使这4个基因的转录水平均下降,而其敲除使acbW和acbA的转录水平分别提高了约100倍和40倍。在凝胶阻滞实验中,ACPL_1889与ACPL_3989均能与acb基因簇的启动子区域结合。最后将正调控基因的强化表达和负调控基因的敲除进行组合,使阿卡波糖产量提升32%。[结论] 本研究发现了9个与阿卡波糖生物合成基因簇的启动子区域结合的调控蛋白,通过体内、体外实验证明ACPL_1889为阿卡波糖生物合成的正调控因子、ACPL_5445和ACPL_3989为负调控因子,不但为揭示阿卡波糖生物合成的转录调控机制奠定了基础,而且这些调控基因的改造显著提升了阿卡波糖的产量。