植物乳杆菌环二腺苷酸合成酶的克隆表达与活性分析

【背景】环二腺苷酸(Cyclic Diadenosine Monophosphate,c-di-AMP)是一种主要存在于革兰氏阳性菌中的重要的第二信使分子,其参与细菌的生长、生存、抗逆性等多种生理活动,但目前关于乳酸菌中c-di-AMP的研究甚少。【目的】从植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中克隆得到c-di-AMP合成酶基因,在大肠杆菌中进行可溶性表达并研究其体外活性。【方法】使用高效液相色谱以及质谱分析对植物乳杆菌-YRA7细胞内容物中的c-di-AMP进行检测;以植物乳杆菌-YRA7基因组DNA为模板,克隆c-di-AMP合成酶基因(lpDacA),构建重组表达载体pET-28a-lpDacA并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,通过Ni-NTA亲和层析纯化后进行体外活性研究。【结果】在植物乳杆菌中检测到c-di-AMP分子;成功构建了c-di-AMP合成酶基因的重组表达质粒,该重组蛋白在大肠杆菌中得到可溶性表达;体外活性分析显示,该重组蛋白可以催化ATP生成c-di-AMP,其活性依赖于二价阳离子的存在,在Mg~(2+)存在以及碱性环境下活性较强;RHR是合成酶活性的关键基序,是环二腺苷酸合成酶与ATP的结合位点。【结论】植物乳杆菌c-di-AMP合成酶的克隆表达及活性分析为进一步研究c-di-AMP在植物乳杆菌中的作用奠定了基础。