发菜中超氧化物歧化酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用基因工程技术从发菜总DNA中克隆了一段的基因序列,该序列与基因库中已公布的编码地木耳（Nostoc commnue）超氧化物歧化酶的氨基酸序列同源性为97%。将该基因插入含T7启动子质粒pET-32中构建表达质粒pET-sod,然后将该表达质粒转入大肠杆菌BL21中进行蛋白表达,表达菌株用1 mmol·L^-1 IPTG诱导表达数小时后,产生较多的重组的蛋白,且该蛋白以可溶性蛋白形式存在。SDS-PAGE分析表明,在相对分子量约为22 kd的位置有一条明显蛋白质带。将诱导表达后的蛋白通过亲和层析的方法进行蛋白纯化;NBT光还原法测定表达产物的比活力,每毫克纯化蛋白约为2 550 U。对纯化后的蛋白进行高温胁迫研究,将该纯化蛋白在60℃高温下胁迫90 min后,其活性为原（未经胁迫）蛋白活性的85%。     

泛素化结合酶E2抑制剂对草菇15 ℃保鲜的影响

为了改进草菇低温保鲜方法,在15 ℃贮藏条件下,采用泛素化结合酶E2 (UBEV2)抑制剂对草菇子实体进行处理,并开展相关生理指标和基因表达检测。结果表明,使用100 μmol/L的UBEV2抑制剂L345-0044维持了草菇较好的品质,提高了草菇可溶性糖的含量。低温明显提升抑制剂处理下的碱性蛋白酶和中性蛋白酶活力,并证实了低温胁迫显著提高了抑制剂处理下的一种类型蛋白酶肽基赖氨酸金属内肽酶的表达。本研究证实了草菇可溶性糖和高活性的冷诱导金属内肽酶对于延长草菇的低温保鲜时间是必须的。     

一株多花黄精内生真菌的鉴别及其抗菌代谢产物

【目的】药用植物内生真菌是一类重要的微生物资源,能代谢产生多种生物活性物质。本研究从浙江庆元百山祖自然保护区多花黄精(Polygonatum cyrtonema)分离获得1株具有抗菌活性的菌株zjqy610。【方法】通过形态和ITS rDNA序列分析,鉴定为变灰青霉(Penicillium canescens)。采用正相硅胶柱层析和凝胶(Sephadex LH-20)柱层析,以紫外光或碘蒸汽显迹,配合活性追踪等,从zjqy610发酵液中分离获得3个具抗真菌活性的化合物。【结果】通过质谱和核磁共振波谱技术分别将其结构鉴定为:乙基氧苯氨基亚胺乙酸(o-acetylbenzeneamidinocarboxylic acid)、灰黄霉素(griseofulvin)和[1,2-b]呋喃2-甲基3-羧甲基4-羟基-5-甲氧基萘(naphtho[1,2-b]furan-3-carboxylic acid,4-hydroxy-5-methoxy-2-methyl-)。抑菌活性测试表明,3个化合物对多种植物病原真菌具有抑制活性,其中化合物zjqy610D-4对番茄灰葡萄孢、圆形炭疽菌、泻根亚隔孢壳和核盘菌4种病原真菌的活性最强,半抑制浓度EC50分别为0.68、0.38、0.91和0.61mg/L。【结论】该化合物具有开发成农用抗生素的价值。     

审视医疗侵权诉讼举证责任的分配

2009年12月通过的《中华人民共和国侵权责任法》规定了患者因为医疗行为受到损害,要求医疗机构赔偿,需要提供证据证明医方的过错。这就改变了《最高人民法院关于民事诉讼证据的若干规定》第4条的过错及因果关系的双推定原则,在平衡患者和法院举证能力,实现诉讼公平方面具有积极的现实意义。     

基于CRISPR/Cas9的蛹虫草无抗性标记转化技术的构建

传统的真菌遗传改造方法需要抗性标记,但目前可使用的抗性标记基因非常有限,导致蛹虫草遗传改造面临着抗性基因数量不足的问题,且尚未能实现多个目的基因的连续敲入或敲除,因此在蛹虫草中建立高效的无抗性标记转化技术显得尤为重要。本研究利用CRISPR/Cas9技术对蛹虫草的Cmura5基因进行编辑,通过内源5S-1、5S-2和U6启动子对gRNA进行转录,结果表明使用U6启动子对Cmura5基因的编辑效率达到了100%。在尿嘧啶缺陷型菌株Cmura5^-中,回补野生型Cmura5基因可实现正向选择,即野生型菌株可以在基础培养基上生长。利用设计的同源臂对Cmura5基因进行回收,可以实现反向选择,即野生型在含有5-氟乳清酸培养基中生长受到抑制。以尿嘧啶缺陷型Cmura5^-为出发菌株,利用无抗性标记转化技术,导入一个重组质粒效率为75%;连续导入2个重组质粒效率为80%;连续导入3个重组质粒效率为100%;连续导入4个重组质粒效率为50%,平均转化效率为75.7%,每一轮的标记回收率均在100%,实现了4个外源基因在蛹虫草中同时表达。     

冻融法转化苜蓿中华根瘤菌

对于苜蓿中华根瘤菌转化方法的研究仅限于三亲杂交法和电激转化,本实验首次将冻融法用于转化苜蓿中华根瘤菌。将携带CUS片段并且含有壮观霉素抗性的质粒用冻融法转移至野生型苜蓿中华根瘤菌菌株,得到的抗性克隆用GUS引物进行PCR扩增鉴定。经过计算,冻融法的转化率为2．2×10^5／μg。与传统方法比较,冻融法操作简单,转化过程快速,转化率较高,所需时间较短,转化成本低,是适合用于苜蓿中华根瘤菌的转化方法。     

结合分子相似性、药效团和分子对接筛选新的HIV-1蛋白酶抑制剂

结合分子相似性、药效团和分子对接建立兼顾计算效率和预测准确度的HIV-1蛋白酶抑制剂筛选方法。首先通过对现有HIV-1蛋白酶抑制剂分子进行相似性分析,选取代表性的HIV-1蛋白酶抑制剂作为模板分子,构建和优化药效团模型,并从1万个化合物中优先筛选出500个化合物。而后采用分子对接方法进一步考察化合物与HIV-1蛋白酶结合情况,得到4个新的活性候选化合物,并进行其结合自由能计算和抗突变性分析。结果表明新候选化合物ST025723和HIV-1蛋白酶表现出较好的相互作用和抗突变性,具有深入研究的价值,同时也证明分子相似性、药效团和分子对接相结合能够快速有效地发现新颖活性候选化合物。     

草菇GH61家族基因的生物信息学分析及金属离子对其表达水平的影响

在前期工作中发现草菇含有30个GH61家族基因同源物（Vv_gh61_1至Vv_gh61_30）,进一步分析了这些基因的结构特点以及其编码蛋白基本性质和系统进化关系,并研究了Cu2+和Mn2+对基因表达水平的影响。分析表明有17个草菇GH61基因串联成6个基因簇,存在明显的串联重复现象,系统发育树与基因外显子位置分析表明串联重复基因分布在同一进化分枝上并具有相似的基因结构,串联重复基因编码序列一致性在71%–94%之间。草菇GH61编码蛋白的氨基酸数目在217–442aa之间,分子量和等电点分别介于22.4–45.4kDa和5.2–9.3之间,绝大多数都含有信号肽并定位在细胞外,都含有Glyco_hydro_61功能域以及CBM1、peroxidase等多样化的功能域,系统进化树表明草菇GH61家族基因具有3个主要进化分枝,与灰盖鬼伞等的GH61基因有较近的进化关系。金属离子诱导作用显示,Mn2+对草菇GH61家族基因的表达水平存在诱导作用而Cu2+的诱导作用不明显。     

运用萎锈灵抗性基因构建香菇聚乙二醇介导的遗传转化方法

【背景】萎锈灵抗性基因作为筛选标记在植物和真菌中得到广泛应用。【目的】构建可以使用萎锈灵作为筛选标记的香菇遗传转化技术。【方法】利用溶壁酶消化培养4 d的香菇菌株411-4的菌丝体获得原生质体,加入适量pL-cbx质粒和聚乙二醇溶液,混合物涂布于再生筛选培养基上,培养后挑选菌落进行验证试验。【结果】在原生质体数目108个和添加4μg质粒DNA的情况下,得到了40个抗性转化子。利用PCR实验和转代实验对转化子进行验证,结果显示38个转化子的抗性可稳定遗传,表明萎锈灵抗性基因整合进入了供试菌株的基因组中。【结论】利用香菇411-4菌株建立了一套运用萎锈灵抗性基因作为分子标记的遗传转化技术体系。     

不同光照条件下观光木茎干液流密度季节变化及其相关因素分析

对100%、40%和8%自然光照条件下一年四季观光木(Tsoongiodendron odorum Chun)幼树茎干液流密度(SFD)以及叶片蒸腾速率(Tr)和气孔导度(Gs)的日变化规律进行了比较,并对SFD与Tr、Gs及部分环境因子的相关性进行了分析。结果表明:一年四季观光木的SFD、Tr和Gs均随光照的减弱而降低。在不同光照条件下,一年四季观光木的SFD均呈昼高夜低的日变化规律,且SFD日均值和日峰值均在100%自然光照条件下最高、在8%自然光照条件下最低。在100%和8%自然光照条件下SFD的日变化趋势基本一致,多数情况下在液流启动时即达到峰值;而在40%自然光照条件下其日变化曲线则为"单峰型",峰值出现在9:15至13:30。除春季外,其他季节在不同光照条件下SFD日均值和日峰值总体上均有显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)差异。夏季在100%自然光照条件下Tr的日变化曲线呈"双峰型",其他季节在不同光照条件下Tr的日变化曲线均呈"单峰型"。在40%和8%自然光照条件下不同季节Gs的日变化曲线也呈"单峰型",且其峰值出现时间与Tr基本相同;而在100%自然光照条件下,冬季Gs的日变化曲线也为"单峰型",但在其他季节则呈"双峰型",并出现明显的"午休"现象。相关性分析结果表明:在不同光照条件下一年四季观光木的SFD与叶片Tr均呈显著或极显著正相关;但与叶片Gs的相关性在不同季节及不同光照条件下有一定的差异。在不同光照条件下,一年四季观光木SFD与叶片水汽压亏缺、大气温度及光合有效辐射强度(PAR)呈正相关,与大气相对湿度呈负相关;其中,与PAR的相关性均达到显著或极显著水平。研究结果显示:在不同光照条件下,PAR是影响观光木SFD四季变化的最主要环境因子。