基于结构的CRISPR蛋白xCas9的优化设计

酿脓链球菌 (Streptococcus pyogenes Cas9,SpCas9) 已成为强大的基因组编辑工具,但其可识别的前间隔序列临近基序 (Protospacer adjacent motifs,PAMs) 范围有限,且存在脱靶效应。为解决这些问题,文中提出一种对SpCas9的定向进化突变体xCas9进行优化的理性方法。首先,使用Rosetta程序进行能量最小化以优化Cas9的三维结构,获得其能量最低的构象;然后,对其定向进化所得氨基酸位点进行组合突变设计;最后,通过自由能排序从设计突变体中筛选出用于实验验证的最优变体。经DNA剪切实验验证,成功地获得了一个多PAM识别和低脱靶的新变体yCas9 (262A/324R/409N/480K/543D/694L/1219T)。该变体可识别NG、GAA和GAT序列,且其由错配sgRNA引导的脱靶DNA剪切活性低,为生物医学领域提供了一个有潜在应用价值的基因编辑工具。同时,文中还对SpCas9、xCas9和yCas9进行了分子动力学模拟,揭示了其PAM识别和脱靶效应的机理,可为进一步的CRISPR/Cas9蛋白优化改造提供理论指导。