响应面-满意度函数优化重组大肠杆菌产NMN转移酶发酵条件

重组大肠杆菌Escherichaia coli能高效表达NMN转移酶,以此为出发菌株,以菌体生长量OD600和NMN转移酶的活力为响应值,对重组大肠杆菌产NMN转移酶的发酵条件进行优化.首先以Plackett-Burman实验设计优化筛选出3个主要影响因子:胰蛋白胨、甘油、MgSO4;随后以Box-Behnken中心组合设计建立上述3个因子对OD600和NMN转移酶活力水平的数学模型;最后通过满意度函数获得最佳发酵条件为:酵母粉30 g/L,胰蛋白胨10.5 g/L,甘油3.49 mL/L,MgSO40.45 g/L,K2 HPO440.5 g/L,KH2 PO46.0 g/L,NH4 Cl 1.5 g/L,NaCl 0.6 g/L,接种量1.5%,诱导时间12 h.在该优化条件下,菌体生长和产酶水平均获得了显著的提升.重组NMN转移酶的活力水平从8.85 U/mg提高到15.48 U/mg,菌体生长量OD600从4.85提高到6.01,提高幅度分别为74.92%和23.92%.     

来源于大肠杆菌的NMN转移酶的克隆表达与酶学性质研究

在生物体内,NMN(烟酰胺单核苷酸)转移酶能够催化NMN生成NAD.本研究通过构建重组表达质粒pET30α(+)-Nmnat,成功实现来源于大肠杆菌的NMN转移酶基因(Nmnat)的原核表达.从大肠杆菌基因组中克隆得到的NMN转移酶基因长度为1 245 bp,所编码的重组酶分子量45 kDa.对重组酶的酶学性质进行分析,结果显示该酶最适反应温度和pH分别为37℃和7.5.4℃下,该酶的热失活半衰期可长达990.2 min.Mn2+、Fe2对该酶的酶活的激活作用显著,而EDTA对酶活能造成明显的抑制作用.酶动力学分析结果显示,该酶对底物NMN催化的Km和Vmax分别为16.89 mmol/L和2.46 μmol/(L·min).该NMN转移酶基因在大肠杆菌宿主中的成功表达,为NAD生物合成应用研究奠定了基础.     

模拟氮沉降对外来入侵植物互花米草生长及化感作用的影响

通过设置室内模拟实验, 从生长特性和化感作用的角度, 探讨了氮沉降对外来入侵植物互花米草入侵潜力的影响。结果表明, 低氮沉降和高氮沉降处理都明显促进了互花米草地上和地下部的生物量累积, 其中低高氮沉降分别使地上部生物量增加161.15%和120.20%, 使地下部生物量增加128.43%和71.06%。而氮沉降使叶面积和叶重也显著增加, 这将增强其对资源的捕获和利用能力。而不同氮沉降处理下互花米草的叶、根水浸液对莴苣种子萌发和幼根生长具有化感抑制作用, 当浸提液浓度相同时, 低氮沉降比其他氮处理有更强的综合化感效应。互花米草叶和根的综合化感效应分别在低氮沉降处理下浸提液浓度为0.02 g⋅mL–1 和0.04 g⋅mL–1 时最大。高氮沉降处理下互花米草各项指标并不完全优于低氮沉降处理, 这可能由于高氮沉降处理下其生长已不处于氮限制状态。全球氮沉降是一个漫长的过程,在目前的氮沉降条件下, 加强对互花米草的防治和管理迫在眉睫。     

保护剂对重组大肠杆菌NMN转移酶稳定性的影响

通过向NMN转移酶( Nmnat)中添加保护剂以提高其热稳定性及储存稳定性,扩大酶的使用范围。研究了固体醇类(山梨醇、甘露醇)、糖类(海藻酸钠、蔗糖、甘露糖)和有机溶剂( DMSO、丙二醇-单甲醚、乙醇、甘油)对Nmnat的稳定性的作用,通过正交实验得到一种复合保护剂,并研究复合保护剂对Nmnat最适反应温度、pH稳定性、储存稳定性的影响。结果表明,山梨醇、海藻酸钠和DMSO能够显著提高Nmnat的热稳定性。复合保护剂配方为山梨醇1.5 g/L,海藻酸钠1.0 g/L, DMSO 0.5%。复合保护剂的添加使Nmnat的最适反应温度从37℃提高到50℃;50℃保温2 h酶活提高了24.5%;pH使用范围由7.0~8.0扩大到6.0~8.0;4℃储存28 d后,酶活保留率提高了15.65%。