电场诱导营养缺陷型酵母原生质体的融合

本文以酿酒酵母营养缺陷型单倍体菌株; Jz-25,a,ura。和Jz-22,a,trp’ade一的原生质体为材料,采用改进的大尺寸电融合小池,以频率为1MHz,强度为450V／cm的正弦交变电场作电介质电泳,使原生质体沿电力线方向排列成串,建立起质膜间的紧密接触;接着以高强度4．5kv／cm、短时程40μs的Rc放电脉冲触发并列质膜的可逆电击穿,引起膜的通透性瞬时增大,从而导致原生质体的融合．为了进一步增大从电极间取出的融合体数目,而克服由于增高交变电场引起的使溶液过热的副作用,实验中还设计了以PEG聚集原生质体后,加高强度7．0kv／cm短时程45μs的可逆电击穿脉冲触发融合的程序。实验结果表明;上述两种电融合程序的融台频率都要比以相同材料所作的纯PEG对照实验的融合频率有所提高。通过对融合产物作交配型检验和测量细胞的尺寸,初步可以证明融合子在质融后已发生核配,产生出二倍体菌株。看来细胞电融台方法可成为一种实际应用的技术。     

酵母整细胞及原生质体的最佳电穿孔条件

本实验系统地研究了椭圆酿酒酵母AS2-607(南阳6号“K”)质膜的电穿孔条件。通过对不同电场条件产生的菌落数的测量,可以确定对原生质体的最佳条件为:RC脉冲电场幅度应为5--10KV/cm 脉冲的时间常数应小于30微秒;为加强电穿孔作用应采取多个一列的短脉冲方式;用链霉蛋白酶和胰蛋白酶作预处理能提高质膜对电场的抗性。而对在28℃下悬浮培养14小时的该种酵母细胞,由于细胞壁的影响,对高达20KV/cm或400微秒的RC脉冲仍无明显的电击穿致死效应。在本实验中,我们发观了以下的三点有趣的结果:对原生质体的膜击穿电压Vm可提高至3.7V,这时仍有足够高的成活率;一列相同的电脉冲的致死率依次序先后递减;对完整细胞作电击穿操作,可大大提高脉冲的幅度和时程。