香菇Latcripin-8蛋白的表达、纯化及抗肿瘤活性

目的通过生物信息学方法分析Latcripin-8的基因序列、功能域片段,构建重组质粒,表达含Pkinase结构域基因的目的蛋白并研究重组蛋白的抗肿瘤活性。方法从香菇C91-3菌丝体中提取总RNA,经反转录成cDNA文库。高通量测序获得转录组mRNA,经对比获得目的序列后以RACE技术扩增。经Pfam数据库比对可知其具有Pkinase结构域。设计引物,PCR扩增并与原核表达载体pET32a(+)进行连接,转至E.coli Rosetta-gami(DE3)中进行蛋白诱导表达,经纯化、复性后获得目的蛋白并鉴定。CCK8法检测其对人肺腺癌A549细胞、人胃癌SGC-7901细胞、人肝癌HepG2细胞及人乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制率。结果蛋白诱导成功且该蛋白对不同种类的肿瘤细胞抑制效果不同,其中对人胃癌SGC-7901细胞的增殖抑制程度最为明显,并表现出时间和浓度依赖性。结论经Latcripin-8基因诱导表达出的蛋白具有抗肿瘤功效,为进一步深入研究抗肿瘤方面的活性提供了初步条件,有助于肿瘤治疗作用的研究。     

香菇C91-3转录本Unigene1245基因的克隆表达 及其抗肿瘤活性研究

摘要：目的克隆香菇C91-3转录本中Unigene1245基因并进行生物信息学分析,研究其编码蛋白的抗肿瘤活性。方法提取香菇C91-3菌丝体总RNA,反转录合成cDNA,经RACE技术获得Unigene1245基因编码序列,通过NCBI对其进行生物信息学分析。设计特异性引物进行PCR扩增,将其克隆到载体pET-32a(+)上,将重组表达质粒热转化至E.coli Rosetta-gami(DE3)中,进行目的蛋白的诱导表达、纯化及复性,通过CCK-8法检测其抗肿瘤活性。结果香菇C91-3转录本Unigene1245基因为YjgF/YER057c/UK114家族成员,成功诱导表达其编码蛋白,CCK-8法结果显示该蛋白对人肝癌HepG2细胞的增殖具有一定抑制作用,且具有一定的时间及浓度依赖性。结论成功克隆并诱导表达Unigene1245基因,并鉴定其具有抑制HepG2细胞增殖的能力,为后续探究抗肿瘤机制奠定了基础。