家蝇抗菌肽Attacin-2基因的克隆、序列分析和诱导表达

攻击素(attacin)作为昆虫抗菌肽之一, 在昆虫的先天免疫中起着重要作用。本研究通过家蝇Musca domestica EST序列筛选并结合RACE技术克隆了家蝇的Attacin-2基因(Mdatta2) cDNA序列。其全长819 bp, 包含一个726 bp的完整开放阅读框(open reading frame, ORF), 以及42 bp的5′末端非翻译区(5′-UTR)和51 bp的3′末端非翻译区(3′-UTR), 编码241个氨基酸残基, 推导的多肽N端22个氨基酸残基为信号肽序列。同源性分析表明, 其氨基酸序列与嗜凤梨果蝇Drosophila ananassae的Attacin一致性最高(46%)。以邻接法(Neighbor-Joining, NJ)构建的系统关系表明, 家蝇的Attacin-2与其他双翅目昆虫的Attacin起源于共同的祖先, 属于Attain_C超家族。应用实时荧光定量PCR的方法研究家蝇幼虫在受到外源细菌刺激时Mdatta2基因的表达, 结果显示, 在大肠杆菌Escherichia coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus分别刺激后3 h和6 h, 家蝇幼虫Mdatta2表达量出现显著上调。Mdatta2基因在家蝇幼虫体内呈诱导型表达, 表达水平随诱导时间的不同而变化, 提示Mdatta2基因可能在家蝇免疫防御过程中起着重要作用。     

IC-ELISA方法检测中国明对虾幼体卵黄蛋白含量变化

卵黄蛋白(Vitellin,Vn)是虾卵黄的主要成分,是胚胎和幼体发育的重要营养源.本实验测定和比较了中国明对虾卵及无节幼体期间Vn的含量;探讨了Vn含量的变化对无节幼体发育的影响,为对虾的幼体发育和饵料研究提供r理论依据.     

家蝇新型抗菌肽Muscin的基因克隆、表达模式及抑菌活性

【目的】鉴定家蝇 Musca domestica (Linnaeus)中一种新型抗菌肽(Muscin)基因,并分析其功能。【方法】通过数字基因表达谱和生物信息学分析,在家蝇转录组中筛选得到一条抗菌肽基因,命名为 muscin。以实时荧光定量PCR技术研究该基因的组织分布以及用大肠杆菌Escherichia coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus混合细菌刺激后的表达量变化。并对合成肽Muscin进行抑菌活性检测及溶血率测定。【结果】muscin基因cDNA序列全长379 bp,包含完整的开放阅读框153 bp。推导Muscin多肽序列由50个氨基酸残基组成,N端含有由25个氨基酸残基组成的信号肽。成熟肽中富含疏水性氨基酸残基和带正电荷的氨基酸残基,理论等电点为9.39。基因定量结果显示 muscin 基因在血细胞和脂肪体中表达量最高。通过细菌刺激进行免疫诱导后,幼虫体内该基因的表达水平明显上调,并在6 h达到高峰。抑菌和溶血实验显示c-Muscin对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有广谱抑菌活性,且溶血活性较低。【结论】Muscin是一种新型的广谱抗菌肽,可能参与家蝇抗菌免疫反应,且具有一定药物开发潜质。     

混养青蛤对南美白对虾池塘氮含量的影响

对虾贝混养池中的氮含量变化规律进行了研究.结果表明,水体内氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的转化过程影响因素仍以自然因素为主,放养青蛤对其变化规律影响不明显.放养青蛤的池塘水体和底泥总氮含量明显栽低于未放养青蛤的池塘,平均值分别为17.08 mg/l、0.075 mg/g和24.42 mg/1、0.11 mg/g.实验说明混养青蛤可以减少养殖池塘中总氮的含量.     

基于Ti4+-IMAC富集的分枝菌酸小杆菌深度覆盖磷酸化蛋白质组研究

【目的】本研究以分枝菌酸小杆菌(Mycolicibacterium smegmatis)为研究对象,探索适于原核微生物理想的磷酸化富集方法。【方法】我们比较了二氧化钛(TiO₂)、Fe³⁺-NTA和Ti⁴⁺螯合在磷酸酯修饰的固相微球(Ti⁴⁺-IMAC) 3种不同富集方法磷酸化肽段的富集效率,并用不同分辨率的质谱仪评估富集稳定性。【结果】Ti⁴⁺-IMAC富集效率最高,磷酸化位点数是TiO₂或Fe³⁺-NTA方法的7倍以上;TiO₂和Fe³⁺-NTA方法富集到的磷酸化位点数相差不大,与已报道的用TiO₂方法富集的磷酸化位点数目接近。Ti⁴⁺-IMAC富集结果稳定性很好,高分辨率Lumos质谱仪鉴定到的磷酸化位点数是Velos的2.6倍。【结论】本研究较高效地实现了分枝菌酸小杆菌磷酸化事件的鉴定,共鉴定到2 280个磷酸化蛋白、10 880个磷酸化肽段及4 433个可信磷酸化位点,有望用于其他微生物的磷酸化蛋白质组学研究。     

家蝇抗菌肽Diptericin基因的克隆与分析

Diptericin是抗菌肽家族中的一员, 在昆虫先天免疫系统中起着重要作用。本研究通过EST序列筛选并结合RACE技术克隆了家蝇Musca domestica的Diptericin基因（Md-Diptericin, MdDpt）cDNA序列, GenBank登录号为FJ794602。其全长410 bp, 包含一个300 bp的完整开放阅读框（ORF）, 推导的氨基酸序列C端富含甘氨酸, N端富含脯氨酸, 同源性分析表明, 它与厩蝇Stomoxys calcitrans的Diptericin A mRNA相似性最高（identity=74%）。以邻接法（Neighbor-Joining, NJ）构建的系统关系表明, 家蝇Diptericin与其他双翅目昆虫的Diptericin起源于共同的祖先, 属于Attain_C超家族（Attacin_C superfamily）。基因定量分析表明, 大肠杆菌刺激后6～12 h, 家蝇幼体MdDpt表达出现明显上调。结果提示MdDpt基因在家蝇免疫防御过程中起着重要作用。     

谢氏宽漠王β-actin基因cDNA克隆、序列分析及表达量检测

β-actin是actin家族的一员,在维持细胞结构、运动和分裂等细胞生理活动方面发挥着重要作用,是基因定量实验中最常用的内参之一。本实验采用同源克隆和RACE技术扩增得到谢氏宽漠王Mantichorula semenowi β-actin基因。序列分析结果表明,该基因cDNA全长1 372 bp,开放阅读框长1 131 bp,编码376个氨基酸,5′和3′末端非翻译区域(UTR)分别为66 bp和175 bp;该序列与其他动物β-actin基因核苷酸序列具有96%～99%高度同源性。β-actin表达量检测结果显示热激后不同恢复时间其表达量无明显变化,且与未经热激处理的对照相比无显著差异。表明β-actin是研究受外界环境胁迫作用下昆虫体内不同基因表达水平的可靠内参基因。     

Mdogg1基因参与家蝇体内氧化还原平衡的维持

[目的]本研究旨在克隆鉴定家蝇Musca domestica中8-羟基鸟嘌吟糖苷酶1(8-hydroxyguanine glycosylase 1,OGG1)编码基因Mdogg1,明确其是否参与家蝇氧化应激调控.[方法]根据家蝇转录组数据,利用RT-PCR克隆Mdogg1基因cDNA序列,并进行生物信息学分析;利用qR...     

家蝇半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因MdCPI的克隆、表达及活性检测

半胱氨酸蛋白酶抑制剂是具有抑制半胱氨酸蛋白酶活性的一类蛋白超家族。本研究根据EST序列信息,通过RACE技术克隆得到1条家蝇Musca domestica半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因MdCPI,该基因含有1个357 bp开放阅读框,编码118个氨基酸残基,推导的多肽N端17个氨基酸残基为信号肽序列。同源分析表明,MdCPI 氨基酸序列与红尾肉蝇Sarcophaga crassipalpis的CPI相似性最高（identity=51%）。以邻接法（NJ）构建的系统树表明,家蝇与其他双翅目昆虫CPI起源于共同的祖先,属于I25A型蛋白家族。为了解家蝇CPI对半胱氨酸蛋白酶的抑制活性,构建pET-17b-MdCPI表达载体,并转入大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）进行重组表达。研究发现1 μg重组家蝇CPI能够抑制约14 μg木瓜蛋白酶的水解活性。结果表明MdCPI确属CPI家族,可能同其他家族成员具有相似的功能,参与免疫及生理调控。这些结果为研究MdCPI在家蝇体内作用机制奠定了基础。     

硫氰酸生成酶样基因在家蝇高温和重金属镉应激中的作用

硫氰酸生成酶同源结构域普遍存在于古细菌、真细菌以及真核生物的多种蛋白分子内,这些蛋白构成一个功能多样的硫氰酸生成酶超家族。本研究根据家蝇转录组序列信息,分拣到一条硫氰酸生成酶样基因的EST序列,经分析发现其编码蛋白C末端含有典型的硫氰酸生成酶同源结构域,属于硫氰酸生成酶超家族,将其命名为家蝇硫氰酸生成酶样基因(Md-Rhodlike)。应用实时定量RT-PCR技术,分析了Md-Rhodlike在热激、镉胁迫条件下的表达量变化。Md-Rhodlike的mRNA水平在高温和镉处理后上调,提示该基因可能参与家蝇对高温及镉金属等环境胁迫因子的耐受,是一种新的家蝇应激相关蛋白。