融合基因umcel5N-CBM的构建、表达及融合酶性质分析

BM,并实现了融合基因在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中的表达.研究结果表明,融合酶Umcel5N-CBM与结晶纤维素(avicel)以及滤纸粉末的结合能力比原始酶Umcel5N提高了约一倍,但未显示出降解结晶纤维素的新活性,说明在结晶纤维素的降解过程中,纤维素酶的催化功能域起到关键作用.     

广西水牛瘤胃中的细菌多样性

[目的]了解广西水牛瘤胃中细菌的组成及其可能的降解纤维素细菌的主要类群。[方法]提取水牛瘤胃内容物和高效降解滤纸的水牛瘤胃内容物的富集培养物的宏基因组DNA,以宏基因组DNA为模板,扩增16S rRNA基因序列,构建该两种样品的细菌的16S rRNA基因文库。通过对16S rRNA基因序列的分析,了解这两种样品的细菌群体种类及数量。 [结果] 水牛瘤胃内容物与其富集培养物中均主要含有LGCGPB (low G+C Gram-Positive Bacteria)、CFB (Cytophaga-Flexibacter-Bacteroides)两大类菌群和少数的螺旋体菌（Spirochaetes）,且LGCGPB所占的比例都是最高的,LGCGPB在水牛瘤胃内容物细菌中的比例为56.66%,而在富集培养物细菌中的比例升高为73.33%。在水牛瘤胃内容物中,丝状杆菌（Fibrobacteres）占3.33%,但在富集培养物中未被检测到。而在富集培养物中占13.33%的变形杆菌（Proteobacteria）,在水牛瘤胃内容物中未被检测到。本研究还发现了分类地位尚未明确的一菌群（R46）。[结论]细菌类群LGCGPB、Proteobacteria可能在水牛瘤胃中的纤维素降解过程中起重要作用。此外,水牛瘤胃中的细菌组成和牦牛、牛、羊瘤胃中的细菌组成较相似但比例有所不同。     

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种8004菌株wxcA基因与EPS的产量有关

在以前的工作中,采用转座子Tn5 gusA5对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xcc)8004菌株进行诱变,获得一批胞外多糖(EPS)合成减少的突变体,对这些突变体的Tn5 gusA5的插入位点进行分析后,发现有两株突变体是wxcA基因不同插入位点的突变体。以前认为wxcA基因与脂多糖(LPS)的O-抗原合成有关而与EPS的合成无关。为明确wxc4基因的功能,对8004菌株的wxcA基因进行缺失,获得的△wxcA突变体的EPS产量与野生型菌株相比,减少了50％,并且一段PCR合成的包含wxcA基因的DNA片段能反式互补△wxcA突变体,恢复突变体的EPS产量。这证实了8004菌株的wxcA基因与EPS的合成产量有关。     

野油菜黄单胞菌分泌组双向电泳样品制备方法的建立

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是十字花科植物黑腐病的病原细菌。我们建立了Xcc的蛋白质组学研究平台,用于分离、鉴定该菌的致病相关蛋白。为了减少胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)对蛋白材料质量的影响,我们构建了EPS缺陷的Xcc8004ΔgumB突变体。本研究以Xcc8004ΔgumB出发菌株,用诱导培养液培养,取细胞上清通过超滤浓缩得到蛋白质粗提物,分别采用丙酮沉淀法、试剂盒纯化法和丙酮沉淀-试剂盒联用法来纯化蛋白质粗提物,通过比较双向电泳的结果优选最佳的样品制备方法。结果证明丙酮沉淀-试剂盒联用法较为理想,所得双向电泳图片清晰,分辨率高。因此,此方法可以用于制备野油菜黄单胞菌分泌组双向电泳样品,并可以满足进一步研究的需要。     

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种中一个与EPS合成有关的新基因的鉴定

用转座子Tn5gusA5对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris,简称Xcc)野生型菌株8004进行诱变,分离到一批胞外多糖(EPS)合成减少的突变体。采用TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)分析突变体的Tn5gusA5插入位点,发现其中一株编号为151D09的突变体的插入位点位于Xcc 8004菌株的基因组编号为XC3695的ORF内,该ORF功能尚未见报道。序列分析表明,该ORF演绎的编码产物与Serratia marcescens的kdtX基因和Klebsiella pneumoniae的waaE基因演绎的编码产物分别具有52%和50%的相似性,并具有第2家族糖基转移酶的功能域, 因此暂将该ORF命名为waxE基因。用同源双交换方法构建了waxE基因的缺失突变体,并采用PCR和Southern杂交的方法对突变体进行了验证。waxE基因缺失突变体在营养丰富培养基的生长繁殖不受影响,但其EPS产量与野生型菌株8004相比,降低35%左右,并且一段PCR合成的包含waxE基因的DNA片段能反式互补waxE基因缺失突变体,恢复缺失突变体的EPS产量,表明Xcc waxE基因与EPS的生物合成有关。     

水牛瘤胃宏基因组的一个新的b-葡萄糖苷酶基因umcel3G的克隆、表达及其表达产物的酶学特性

以木质纤维素为原料、应用同步糖化共发酵工艺发酵生产酒精时需要酸性中低温高活力纤维素酶包括b-葡萄糖苷酶。本工作分6次构建了水牛瘤胃未培养微生物宏基因组文库, 获得1.26×105个克隆, 文库含外源DNA的总长度 约为4.8×106 kb。从文库中筛选到118个表达b-葡萄糖苷酶活性的独立克隆。发现其中8个克隆表达的b-葡萄糖苷酶在pH5.0、37oC条件下活性较强。对其中一个克隆进行了亚克隆, 序列分析发现一个2223 bp的潜在的编码b-葡萄糖苷酶基因(umcel3G)的开放阅读框(ORF), 其编码产物的氨基酸序列与来自于 Bacillus sp.的一个b-葡萄糖苷酶同源性最高, 具有60%的一致性和73%的相似性。该ORF在E.coli中的表达产物Umcel3G的分子量与预测大小相似, 酶谱分析表明该表达产物具有b-葡萄糖苷酶活性, 证实该基因为一个b-葡萄糖苷酶基因。测定了用Ni-NTA纯化的Umcel3G的酶学特性, 其最适pH和最适温度分别为6.0~6.5和45oC。一些金属离子如Ca2+、Zn2+能显著提高该酶的酶活, 而另外一些金属离子如Fe3+、Cu2+能抑制Umcel3G的活性。在pH4.5、35oC和5 mmol/L的 Ca2+存在的条件下, 用Ni-NTA纯化的重组酶的比活为22.8 IU/mg, 说明该酶在用SSCF工艺发酵生产酒精中有潜在的应用价值。     

辣椒CaNPR1-RNAi表达载体的 构建及其对辣椒的转化

从辣椒中克隆到一个与拟南芥系统获得抗性正调节基因NPR1同源的CaNPR1基因的全长cDNA。辣椒CaNPR1基因与拟南芥NPR1基因在mRNA水平上同源性为62.9%,两者的编码产物一致性为49·7%,相似性为65.7%。为鉴定该基因的功能,构建了一个以CaNPR1基因为靶基因的RNA干涉辣椒表达载体pCaNPR1-RNAi,并用根癌农杆菌介导法转化辣椒桂研五号,共获得了6株卡那霉素抗性再生苗,经Southern杂交证实,这些再生苗均为转基因植株,为进一步鉴定该基因的功能奠定了基础。     

野生稻和栽培稻的随机多态DNA(RAPD)分析

应用 RAPD方法对药用野生稻、普通野生稻、粳稻和籼稻进行基因组多态性分析。 1 2个随机引物共扩增出 1 3 2条 RAPD带 ,片段大小在 3 0 0～ 3 5 0 0 bp之间 ,其中有 1 0 6条表现出多态性 ,占总扩增片段的86.4%。根据遗传距离分析 ,用 UPGMA法构建了聚类树状图 ,结果表明 ,普通野生稻的遗传特性比药用野生稻更接近于栽培稻。     

十字花科黑腐病菌非编码RNA SR220与RsmA的相互作用关系及SR220剪切位点的初步鉴定

次生代谢抑制(Repression of secondary metabolism, Rsm)调控系统是一个由RNA结合蛋白RsmA以及非编码RNA组成的广泛存在于细菌中的全局转录后调控系统。RsmA蛋白是Rsm调控系统的核心,它通过与靶标mRNA结合来控制基因表达;而非编码RNA的作用是抑制RsmA蛋白的调控活性。研究表明,在一些细菌中,RsmA可以通过复杂的调控网络在转录水平正向调控这些抑制它的非编码RNA的表达。本实验室前期研究发现,在十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)中,SR220是抑制RsmA活性的非编码RNA,但RsmA是否调控SR220的表达目前还不清楚。本研究使用Northern杂交技术检测和比较了野生型菌株和rsmA缺失突变体中SR220的表达水平。结果发现,尽管在野生型菌株中SR220正常表达,但在rsmA缺失突变体中却检测不到SR220的信号,证明SR220的产生需要RsmA。更重要的是,进一步的实验发现,SR220的产生需要其与RsmA直接结合,说明RsmA是在转录后水平,而不是像其他细菌在转录水...