猪Gli1基因的克隆、表达谱分析及脂肪组织特异性表达载体的构建

Hedgehog(Hh)信号通路对动物脂肪沉积具有抑制作用,并且从果蝇到脊椎动物具有高度保守性,但在家猪研究中鲜见报道。文章选择家猪Hh通路的转录激活因子Gli1进行研究,通过RT-PCR结合RACE技术,首次获得家猪Gli1基因cDNA全长,利用Real-time PCR对家猪Gli1基因在不同组织中的表达丰度进行了分析,并构建了真核表达载体和脂肪组织特异性表达载体。结果表明:猪Gli1基因cDNA全长3 576 bp,基因组序列全长10 715 bp,共12个外显子,编码1 106个氨基酸。生物信息学分析表明,猪Gli1为不稳定亲水性蛋白,不具有跨膜结构域和信号肽序列,但具有锌指结构与核定位序列。对7个物种的Gli1蛋白序列和基因组序列相似性进行分析,发现各物种间序列相似性均在80%以上,说明Gli1在物种间高度保守。组织表达谱分析表明,Gli1仅在成体猪舌组织中表达;在家猪脂肪组织发育进程中,Gli1仅在出生1周的猪脂肪组织中检测到微弱表达,但1月龄及3月龄猪脂肪组织中均检测不到表达,由此推断猪Gli1表达与脂肪组织发育呈负相关。最后,将猪Gli1编码区克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP,体外转染实验证明该载体能够正确表达猪Gli1,另外还构建了脂肪组织特异性表达载体,为构建脂肪组织特异性转基因动物奠定基础。