人胸腺素α原cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用基因工程方法制取人胸腺素α原获得成功。用２０ｕｇ／ｍｌ植物血球凝集素（ＰＨＡ）和５００Ｕ／ｍｌ重组人白细胞介素２（ＩＬ－２）联合刺激人胎儿胸腺细胞,从中提取总ＲＮＡ,经反转录ＰＣＲ获得了人胸腺素α原ｃＤＮＡ;将之克隆入ｐＵＣ１９中,序列测定表明与已报道序列一致,进一步将之亚克隆入原核表达载体ｐＢＶ２２０,转化大肠杆菌ＤＨ５ａ．观察到在不改变氨基酸编码的前提下,增加胸腺素ａ原上游引物中Ａ、Ｔ含量,可以明显提高胸腺素α原的表达量,同时,不同培养基对它的表达也有影响。胸腺素α原在大肠杆菌中以可溶形式表达,不需复性。初步活性测定显示,它可明显刺激人外周血淋巴细胞Ｅ－玫瑰花结形成率。重组人胸腺素α原在大肠杆菌中表达,为其临床应用及基础研究奠定了基础。     

XBP-1转录激活系统的构建

人X盒结合蛋白1(XBP-1)是CREB／ATF(cAMP应答元件结合蛋白／激活转录因子)转录因子家族中的一员,在很多癌细胞中高水平表达。将XBP-1两种剪切形式的编码序列分别克隆在pRC-lac真核载体上,构建成pRC-lac-XBP-1S和pRC-lac-XBP-1U重组质粒。Westem印迹分析表明,这两种XBP-1形式在哺乳动物细胞中都得到了表达。瞬时转染人胚胎肾细胞293T,用荧光素酶报告基因检测这两种剪切形式的转录活性。结果显示,pRC-lac-XBP-1S和pRC-lac-XBP-1U在293T细胞中均有活性,pRC-lac-XBP-1U的活性约是空载体的65倍,pRC-lac-XBP-IS的活性约是空载体的3倍。成功构建了xBP-1的转录激活系统,为进一步了解XBp-1在各种疾病中的作用奠定了基础。     

SRAP、ISSR技术的优化及在甘蓝类植物种子鉴别中的应用

将SRAP与ISSR 2种分子标记技术应用于8种甘蓝类植物（Brassica oleracea L.）的种子鉴别中。先以甘蓝（Brassica oleracea var. capitata）基因组DNA为模板,通过对SRAP、ISSR反应体系中各影响因素的逐一筛选,优化了甘蓝类植物SRAP、ISSR反应体系。进而采用30个SRAP引物组合和15个ISSR引物对白甘蓝、皱叶甘蓝、红甘蓝、羽衣甘蓝、花椰菜、青花菜、抱子甘蓝、球茎甘蓝的基因组DNA进行了PCR扩增,结果表明：M3E5与M4E5两个SRAP引物组合可以在8种甘蓝类植物之间显示较高的多态性;844和888两个ISSR引物也可在8种甘蓝类植物之间产生很好的多态,特别是844引物单独应用即可区分所有材料。     

小鼠胚胎干细胞分化形成拟胚体过程中的细胞程序性死亡

为了检测小鼠胚胎干细胞 (embryonicstemcell ,ES细胞 )体外分化的拟胚体 (embryoidbodies ,EBs)形成过程中细胞程序性死亡 (programmedcelldeath ,PCD)的发生 ,通过悬滴、悬浮培养技术定向诱导未分化的ES细胞分化为拟胚体 ,并用RT PCR检测原始内胚层、原始外胚层、中胚层、内脏内胚层 4种分子标记物在EBs中的表达 .通过TUNEL染色、电镜、激光共聚焦显微镜及Western印迹以确定凋亡发生 .结果表明 :ES细胞体外分化为拟胚体并且表达各胚层相应的分子标记物 ;在拟胚体的发育过程中出现明显的空腔化过程 ,TUNEL染色及电镜观察到凋亡生成 ,同时线粒体膜电位 (ΔΨm)在拟胚体发育过程中降低 ,通过Western印迹检测到caspase3、caspase8的激活 .表明小鼠ES细胞所分化的拟胚体可以作为研究早期胚胎发育的实验模型 ,线粒体在拟胚体的细胞程序性死亡过程中发挥重要的作用 .为进一步利用拟胚体研究细胞程序性死亡及相关信号分子在小鼠胚胎发育早期的作用奠定了基础     

浅谈美国对生物工程的管理

生物技术是一项切实可行的技术,它已在基础研究、工业和商业的许多方面得到了广泛的应用,因此,不同部门之间的协调管理实属必要。1986年,美国政府在生物工程领域的协调大纲(Coordinated Framework)的出台标志着管理政策的开始。 协调大纲是一项广泛而复杂的协调政策,它解释了现存的对生物工程管理政策的使用,也阐述了各部     

Smad2条件基因剔除载体的构建及LoxP位点有效性鉴定

Smads家族是最新发现的TGF－β信号转导途径中一个重要的新基因家族,SMAD2属于受体激活的SMADs。Smad2在某些肿瘤中发生突变,是一种可能的肿瘤抑制基因。Smad2基因完全剔除小鼠在胚胎期E6．5天死亡,为了研究Smad2在成体各组织器官及肿瘤发生中的可能作用,构建了Smad2条件基因剔除载体,将LoxP置于Smad2基因组序列C末端功能域两侧,并在组成型表达Cre重组酶的大肠杆菌中检测了LoxP位点的功能,该载体的构建为进行Smad2组织特异性基因剔除研究了奠定了基础。     

HBV基因组中GRE相关的DNA片段能介导多种激素对转录的调节作用

乙型肝炎病毒(HBV)能引起急性和慢性的乙型肝炎,慢性HBV感染可能导致肝硬变,最终引发肝细胞癌(HCC)。在世界范围内慢性HBV感染几乎波及三亿人,其中四分之三在亚洲。一些研究结果表明男性遭受慢性HBV感染、肝损伤和肝细胞癌的危险性高于女性。许多临床报告证明,给慢性HBV患者服用可的松类甾类激素可使患者血清中的HBsAg水平上升,同样的激素处理也能使培养细胞中的HBcAg表达水平升高。1988年Tur-Kaspa等用DNaseⅠ足迹法证实HBV基因组含有一个糖皮质激     

Tet-On3G系统调控人巨细胞病毒蛋白pUL23稳定表达的人胚肺成纤维细胞(HELF)系的建立

人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)为疱疹病毒家族一员,易导致免疫力低下或缺陷的人群严重疾病,目前对HCMV编码的皮层蛋白pUL23功能的相关报道很少。本研究应用Tet-On3G诱导表达系统,在人胚肺成纤维细胞(Human embryonic lung fibroblast,HELF)建立诱导表达HCMV病毒蛋白pUL23细胞模型。将病毒基因UL23和阳性对照基因EGFP分别定向插入应答慢病毒载体pLVX-TRE3G中,获得pLVX-TRE3GUL23-3×Flag、pLVX-TRE3G-EGFP重组慢病毒载体。运用二代慢病毒包装系统与Lenti-X293T包装细胞系,制备收获慢病毒后感染人胚肺成纤维细胞HELF。遗传霉素(Geneticin,G418)和嘌呤霉素(Puromycin,Puro)抗性筛选后多西环素(Doxycycline,Dox)诱导外源基因表达。感染后的细胞在96孔板有限稀释法成单克隆,分别采用RT-PCR与Western blot技术检测病毒UL23基因在mRNA水平与蛋白水平的表达量,筛选出当诱导时高效表达且未诱导时低表达的单克隆细胞;并评估Dox诱导剂量与诱导时间对外源蛋白pUL23表达的影响。限制性内切酶与测序显示重组质粒pLVX-TRE3G-UL23-3×Flag、pLVX-TRE3G-EGFP序列和方向正确。病毒蛋白pUL23在感染细胞中能够被诱导表达;当Dox浓度高于400ng/mL时pUL23蛋白表达量不再随Dox剂量增高而增高。在Dox诱导2h后,RT-PCR结果表明在921bp处有特定条带(UL23-3×Flag基因)与此同时,Western blot实验也检测到pUL23蛋白。这些结果表明,成功构建重组慢病毒载体,包装成慢病毒感染后,病毒基因UL23能够在人胚肺成纤维细胞中诱导表达。Dox的最佳工作浓度为400ng/mL,最佳诱导时间为12h至24h之间。这将为进一步研究病毒蛋白pU23的功能奠定基础。     

重组α-银环蛇毒素的纯化及活性分析

以表达重组α-银环蛇毒素的高效表达菌株BL21(PDZ04)为材料,研究重组α-银环蛇毒素(α-bungarotoxin,α-BgTx)的分离纯化。采取亲和色谱和离子交换色谱的方法都得到了重组α-银环蛇毒素的纯品。参考文献报道的方法从天然的银环蛇毒干粉中分离纯化得到了天然α-银环蛇毒素的纯品。然后以天然α-银环蛇毒素为对照来检测重组α-银环蛇毒素的抗原性和毒性。ELISA结果显示其具有与天然α-银环蛇毒素相似的抗原性,以小鼠为动物模型,纯化的重组α-银环蛇毒素与天然α-银环蛇毒素相比,其腹腔注射的LD50也基本一致,约为0.22μg/g。结果表明利用基因工程的方法生产蛇神经毒素是可行的。     

蛇毒类凝血酶calobin在毕赤酵母中的表达

蛇毒类凝血酶是临床上防治血栓栓塞性疾病的有效药物。参照朝鲜蝮蛇(Agkistrodon caliginosus,Korean Viper)类凝血酶calobin基因序列(GenBank AccessionNo.U32937.1),将人工合成的calobin基因克隆到酵母表达载体pPICZαA,于毕赤酵母中表达,得到了分子量约为32kD的重组calobin蛋白,经甲醇诱导培养,表达产物可获得3.5g/L的高表达量。重组蛋白经过阴离子交换柱Q-Sepharose Fast Flow和分子筛Sephacryl-S-100凝胶过滤层析等纯化步骤进行了初步纯化。纯化后的重组calobin可以在纤维蛋白原平板上形成水解圈,经SDS-PAGE实验显示,重组蛋白能水解纤维蛋白原的Aα链,产生一条约40kD左右的降解带。在实验中未能发现重组calobin对纤维蛋白原的凝固作用。