排序方式: 共有18条查询结果,搜索用时 276 毫秒
1.
来源于超嗜热古菌Alicyclobacillus acidocaldarius的酯酶EST2是目前报道的活性最高的超嗜热酯酶,具有极大的工业应用价值。为促进EST2的生产应用,将其分别在大肠杆菌及毕赤酵母中进行异源表达,并就不同宿主对表达情况和重组酶酶学性质的影响进行了分析。在大肠杆菌和毕赤酵母中重组表达的EST2酶学性质基本一致:最适温度分别为75℃和77.5℃,最适pH均为8.0,比活力分别为4656.6 U/mg和4078.3 U/mg,70℃水浴保温4.5 h,残余活力均在70%以上。在摇瓶发酵的基础上,于5 L发酵罐中进行了重组大肠杆菌及毕赤酵母的高密度发酵。毕赤酵母高密度发酵120 h菌体干重达68 g/L,最大表达酶活力为959.6 U/ml。大肠杆菌高密度发酵25 h菌体干重达60.8 g/L,最大酶活力14825.6 U/ml,表达量是毕赤酵母的15.4倍,单位时间产量是酵母的74.2倍。结果表明大肠杆菌发酵周期短、表达量高,更适合进行嗜热酯酶EST2的高效生产,这为促进嗜热酯酶在工业生物技术产业的应用奠定了基础。 相似文献
2.
3.
嗜热酯酶APE1547催化活性的定向进化研究 总被引:1,自引:0,他引:1
对来源于嗜热古菌Aeropyrum pernix的酯酶(APE1547)催化活性进行定向进化研究。利用APE1547特殊的稳定性,建立了准确的高通量高温酯酶筛选方法。对第一代随机突变库筛选获得了催化活性较野生型提高1.5倍的突变体M010,序列分析表明其氨基酸突变为R526S。从第二代突变库中筛选出的总活力提高5.8倍突变体M020,突变位点为R526S/E88G/A200T/I519L,其比活力与M010一致,但表达量比野生型提高约4倍。对M020酶学性质表征发现,其最适pH为8.5,比野生型向碱性偏移0.5;活性中心残基酸性基团的解离常数(pK1)由野生型的7.0提高至7.5。晶体结构分析表明,突变位点R526距离活性中心较近,将其突变为Ser降低了活性中心的极性,抑制了催化残基His的解离,使酸性基团的解离常数升高。 相似文献
4.
5.
基于荧光激活细胞分选(FACS)技术的超高通量酶活性筛选方法是新出现的一类高通量筛选技术.它利用流式细胞仪高灵敏度、高通量的特点,能以极高的速度(108/天)对大容量酶基因文库进行筛选.FACS筛选技术的出现突破了常规筛选方法低效、耗时、费力等瓶颈问题,极大地提升了人类对大容量基因文库的探索能力,因此在新酶基因筛选、酶活性检测、酶定向进化等领域有广泛的应用潜力.综述了FACS超高通量酶活性筛选方法的最新研究进展,着重介绍了其在酶定向进化中的应用. 相似文献
6.
目的以PCR方法检测溶血葡萄球菌mecA基因为标准,评价头孢西丁纸片扩散法、苯唑西林纸片扩散法和VITEKGPS109卡微量肉汤稀释法检测耐甲氧西林溶血葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus haemolyticus,MRSH)的敏感度和特异性。方法用PCR扩增临床分离的114株溶血葡萄球菌.检测特异性的mecA基因片段;头孢西丁纸片扩散法、苯唑西林纸片扩散法和VITEK GPS109卡微量肉汤稀释法检测溶血葡萄球菌中耐甲氧西林的溶血葡萄球菌。结果114株溶血葡萄球菌经PCR法检测,MRSH有97株,占85.1%;头孢西丁纸片扩散法、苯唑西林纸片扩散法和VITEKGPS 109卡微量肉汤稀释法检测MRSH分别有92、65、93株.与mecA基因法结果比较,头孢西丁纸片扩散法、苯唑西林纸片扩散法和VITEK GPS109卡微量肉汤稀释法敏感性分别为94.8%(92/97)、67.0%(65/97)、93.8%(91/97);特异性分别为i00%(17/17)、100%(17/17)、88.2%(15/17)。矿检验,头孢西丁纸片扩散法和mecA基因法差异无显著性。结论头孢西丁纸片扩散法检测MRSH具有很高敏感度和特异性,是筛选和确认MRSH的一种可靠方法。 相似文献
7.
溶解性多糖单加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenases,LPMO)是近年来新发现的一类作用于结晶多糖(如纤维素和几丁质)的氧化酶;LPMO通过氧化的方式来裂解底物从而有利于水解酶系进一步作用,获得可溶性寡糖。为获得更多新酶资源,通过PCR方法从Actinosynnema mirum DSM 43827菌株中成功地克隆了编码LPMO的基因Amir_5334;将该基因构建到含麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein,MBP)标签的pET-28a(+)载体(pET-28a-MBP)上,并转化至E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达。利用镍柱亲和层析进行纯化,获得融合表达蛋白后,使用Factor Xa蛋白酶切除MBP标签,最终得到成熟的LPMO(Am5)。成熟Am5的预测分子量约为26 kDa,等电点为8.3。分析Am5序列发现,Am5与同家族中LPMO的序列一致性较低,具有良好的序列新颖性。酶学性质分析表明Am5是对几丁质有氧化活性而对纤维素无氧化活性的LPMO;与几丁质酶协同降解几丁质时可提高几丁质酶60%的水解效率;吸附实验显示,Am5对几丁质具有较强的吸附作用,而对纤维素吸附能力较弱。以上研究表明,Am5是一种针对几丁质底物具有高效选择性的新型氧化酶。 相似文献
8.
α-淀粉酶是一种内切糖苷水解酶,可以水解淀粉等多聚糖内部的α-1,4-糖苷键,生成低聚糖、糊精、麦芽三糖、麦芽糖和少量葡萄糖。由于α-淀粉酶在食品、人体健康监测和制药方面的重要作用,其活性检测广泛应用于工业生产菌株的选育、临床疾病的诊断、糖尿病药物的开发和食品质量的控制中。近年来,随着检测技术的发展,许多更加快速、灵敏的α-淀粉酶检测方法被开发出来。本文综述了近年来α-淀粉酶的检测方法和应用研究进展,分类介绍其检测原理和优缺点,并对未来α-淀粉酶检测方法提出展望,以期为α-淀粉酶检测方法的开发和应用提供参考。 相似文献
9.
[目的]对鞘糖脂内切糖苷酶EGCaseⅡ进行半理性设计,获得高水解活性突变体。[方法]用半理性设计方法进行突变库设计,利用HPLC对突变库进行筛选,随后对阳性突变体进行动力学及底物谱表征,并利用结构建模对活性提高的分子机制进行解析。[结果]获得了对鞘糖脂GM1、GM3水解活性提高的突变体S63G/D311E、I276L/D311V,活性分别提高为野生型的25.3倍、11.8倍。酶动力学表征显示,S63G/D311E的K_M由0.17 mmol/L降低到0.06 mmol/L,kcat由5.5 min~(-1)增大到50.3 min~(-1)。酶-底物复合物模式结构分析表明,D311E、D311V、I276L这几种突变更有利于酶与底物结合,从而提高酶活性。[结论]通过半理性设计成功获得对GM1和GM3水解活性分别提高25.3倍和11.8倍的EGCaseⅡ突变体。 相似文献
10.
L-氨基酸氧化酶(LAAO)是一类生物体内参与氨基酸氧化代谢的重要氧化还原酶,能够以氧分子为电子受体催化L-氨基酸氧化脱氨,生成相应的酮酸、氨(NH3)和过氧化氢(H2O2).近期发现有些LAAO能够专一性识别特定氨基酸,而不受其他种类氨基酸的干扰,因而在手性胺类化合物拆分、α-酮酸生物合成、临床样本、食品及氨基酸发酵过程中氨基酸含量检测等领域都发挥着重要作用.本文重点综述目前研究报道的底物专一性LAAO,总结并比较这些酶的酶学性质、结构功能,以及家族进化规律等,并进一步讨论这些酶在生物催化及氨基酸检测中的应用.本综述将为底物特异性LAAO的分子机制研究及产业应用研究提供重要的素材和指导. 相似文献