人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白在CHO细胞中的表达

干扰素α2b(interferonα2b,IFNα2b)是一种用于病毒性疾病和肿瘤性疾病治疗的多功能细胞因子,因其在体内的半衰期短限制了其在临床上的应用。将IFNα2b连接到人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)的C端,构建融合蛋白HSA-IFNα2b。构建含融合蛋白的真核表达质粒p MH3/HSA-IFNa2b,经电转的方法转入中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞中。经G418抗性压力筛选和目的蛋白的表达量筛选,最终获得一株高表达的稳定细胞株(CHO/p MH3/HSA-IFNa2b)。表达的目的蛋白经Western blot验证显示,产物具有IFNα2b和HSA的双抗原性。经悬浮驯化稳定后,通过批次筛选得到一株稳定的高克隆表达株,产量约为65mg/L,进一步选取高表达克隆株在悬浮驯化中不同代数进行批次培养,不同代数之间蛋白质的表达量和生长情况没有明显的差异,获得一株稳定遗传表达的单克隆细胞株,3L摇瓶的流加培养结果显示,最佳发酵时间为15天,蛋白质表达量为121mg/L。经离心获得的发酵液,经两步纯化后获得蛋白质纯度高达96.8%的目的蛋白,总回收率为22.3%。参照《中国药典》2015版对IFNα2b的检测方法,结果显示,CHO表达的HSA-IFNα2b比活性为4.16×106IU/mg。首次将HSA-IFNα2b在哺乳动物细胞CHO中构建表达,表达获得高活性的HSA-IFNα2b融合蛋白。     

毕赤酵母GS115表达HSA-GCSFm的诱导工艺研究

本文探讨了甲醇流加控制、添加胰蛋白胨和甲醇/山梨醇共混诱导对重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-HSA-GCSFm表达HSA-GCSFm的影响.结果显示:甲醇供应充足条件下HSA-GCSFm表达水平仅为37 mg·L-1,而甲醇添加受限条件下HSA-GCSFm表达水平可达到239mg·L-1;甲醇添加受限并添加胰蛋白胨条件下,HSA-GCSFm表达水平可以提高到266 mg·L-1;在此基础上,流加山梨醇作为辅助碳源,表达水平可大幅提高至424 mg·L-1.通过对各诱导条件下OUR、胞外蛋白酶及碳流分配进行分析后发现,将甲醇限制在低浓度同时添加胰蛋白胨与山梨醇,可以改善细胞代谢活性,增加细胞用于HSA-GCSFm合成的碳流分配量,降低胞外蛋白酶活性,从而提高了HSA-GCSFm的表达水平并缓解了HSA-GCSFm的降解.因此,该诱导工艺适于毕赤酵母高效表达HSA-GCSFm.     

人乳腺癌多药耐药细胞系MCF-7/MDRa的建立及其生物学特性的初步研究

实验以MCF-7细胞株为亲本细胞,采用阿霉素(ADM)低浓度持续加量诱导法建立了多药耐药的人乳腺癌细胞系MCF-7/MDRa,并对其耐药谱、动力学周期分布、表型变化、药物的蓄积量等生物学特性进行了初步分析评价。结果表明,MCF-7/MDRa细胞较亲本细胞的ADM半数致死浓度(IC50)高500倍,撤药培养150天后耐药指数仍维持在200倍以上,并对多种化疗药物产生交叉耐药性;耐药细胞分化程度低于同步传代的MCF-7细胞,细胞倍增时间与亲本细胞接近,S期细胞显著增加,G1期细胞减少;随着撤药时间的延长,细胞的增殖速度加快;耐药细胞P-gP、LRP和GSTπ的表达水平较亲本细胞有显著增加,ER阳性表达丢失;在稳定生长的撤药培养6天的细胞中仍有ADM蓄积。建立的MCF-7/MDRa模型具有多药耐药细胞的基本生物学特性,可用于肿瘤多药耐药机制的研究。     

人胰高糖素样肽-1及其突变体在大肠杆菌BL21中的表达与生物活性研究

以人胰高糖素样肽-1（human glucagons-like peptide-1,GLP-1））为研究对象,以克隆载体pPblu2SKP/（GLP-1A2G）2基因为模板,利用PCR扩增获得GLP-1与其突变体GLP-1A2G的编码基因,并将其插入原核表达质粒pGEX-4T-1中,利用氯化钙法将其转入表达宿主大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中诱导表达,经IPTG诱导后,收集菌体。菌体经超声破碎后,裂解液用GST亲和层析纯化得到融合蛋白,经凝血酶酶解,用Superdex G-75凝胶层析,得到GLP-1及其突变体GLP-1A2G的样品,经SDS-PAGE电泳测定,样品纯度〉90%。小鼠糖耐量试验表明,相对于空白对照组而言,GLP-1及其突变体GLP-1A2G可以明显地控制血糖的水平,两者的生物活性并无明显差异。由于突变体GLP-1A2G较GLP-1可以更加有效的抵制DPPⅣ的降解,提示突变体GLP-1A2G较GLP-1在白蛋白融合或PEG修饰等方面具有更大的优势。     

两株耐紫杉醇人乳腺癌细胞MCF-7的比较

建立稳定的肿瘤多药耐药(MDR)细胞株是肿瘤MDR机制研究的基础,以MCF-7细胞林为亲本细胞株,采用低浓度加量持续诱导和高浓度短期作用分别建立MCF-7/Taxola和MCF-7/Taxolb细胞模型,并对其耐药谱、动力学周期变化、表形变化、细胞侧群分布、药物蓄积等生物学特性比较评价.结果表明,MCF-7/Taxola和MCF-7/Taxolb细胞的紫杉醇(paclitaxel/Taxol)半数抑制浓度(IC50)分别是亲代MCF-7细胞的525倍和330倍,并且都对多种化疗药物交叉耐药;MCF-7/Taxola细胞S期细胞显著增加,G,期细胞减少;MCF-7/Taxolb细胞各个期变化不大;MCF-7/Taxola细胞P-糖蛋白(P-gP)、肺耐药相关蛋白(LRP)和还原型谷胱甘肽-S转移酶(GSTπ)的表达水平较亲代有显著增加,而MCF-7/Taxolb细胞GSTπ的表达水平较亲代也有显著增加,另外,拓扑异构酶Ⅱ(ToPoⅡ)在两株耐药细胞中表达都明显下降,而两株细胞雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)阳性都表达丢失;光镜下耐药细胞MCF-7/Taxola明显变大并且形态不规则而MCF-7/Taxolb变化不大;电镜下MCF-7/Taxolb表面纤绒毛成小球状隆起和絮状,而MCF-7/Taxolb表面成絮状:MCF-7/Taxola撤药10天后细胞中有紫杉醇蓄积,而MCF-7/Taxolb中没有紫杉醇蓄积.两个模型都具有MDR的基本生物学特性,可用于肿瘤MDR机制的研究,通过两种耐药细胞的比较,推测MCF-7/Taxolb细胞是MCF-7/Taxola细胞的一个亚群.     

GLP-1类似物活性检测细胞模型的建立及其功能分析

为探索GLP-1类似物活性检测模型在活性检测过程中影响稳定性与重复性的因素,该文以中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞为模型细胞,构建真核表达载体p EGFP-N1/h GLP-1R-EGFP,并将其转染至CHO中,经过G418抗性筛选和流式细胞仪分选富集后有限稀释,筛选获得一株稳定高表达的单克隆细胞株。倒置荧光显微镜分析、流式细胞术分析以及RT-PCR实验结果显示,此检测模型转录和翻译了h GLP-1R-EGFP基因,并且表达的受体蛋白质位于细胞膜侧。以利拉鲁肽和艾塞那肽作为模型药物进行活性检测分析,结果显示,该检测模型具有极高的药物灵敏度,不同代数模型细胞测活相对稳定。该文还进一步探索了影响GLP-1类似物EC50测量值的因素,主要包括模型细胞受体表达量、胎牛血清以及其单一组分BSA。综上所述,构建的细胞模型在检测GLP-1类似物活性中,具有较好的稳定性和可重复性,为GLP-1类似物的药物筛选与活性评价提供方便可靠的模型基础。     

生物素化白藜芦醇的分离纯化与药效学评价

以DCC为催化剂,采用低温化学催化法合成生物素化白藜芦醇.产物采用Resourse RPC反相色谱柱分离、纯化,并且运用液质联用进行分析验证.MTT法测定产物体外对Hep G2、MCF-7肿瘤细胞的抑制作用.实验结果显示:通过HPLC-MS、紫外扫描分析鉴定证实,分离得到的产物确实是生物素化白藜芦醇,其保留了原有的体外抗肿瘤活性.此种化学合成方法反应条件温和,容易控制,操作方便.合成得到的白藜芦醇的生物素化衍生物,为下一步探讨白藜芦醇的结合蛋白提供简单有效的分子工具.     

合欢皮提取物抑制血管生成作用的研究

本文采用体外细胞培养法和体内鸡胚尿囊绒膜模型、荷瘤模型检测合欢皮提取物抑制人微血管内皮细胞(HMEC-1)的增殖、迁移活性,观察合欢皮提取物的抑制血管生成情况。发现合欢皮提取物能显著抑制HMEC-1的增殖(IC50为30μg/mL)和迁移,并且呈明显的剂量依赖性。在体内同时具有抑制鸡胚尿囊膜和肿瘤组织中血管生成的作用。     

循环包装回收技术在筛选肝癌细胞相关耐药基因中的应用

肝癌先天性多表达多药耐药基因,严重影响肝癌的化疗效果,筛选肝癌细胞中的耐药基因,研究其耐药机制有助于提高肝癌化疗效果,提高肝癌的治愈率。首先构建肝癌细胞逆转录病毒的cDNA文库,感染成纤维细胞,使得逆转录病毒基因整合进细胞,加药筛选,存活细胞中的基因再次包装成病毒,用于下一轮筛选。采用循环包装回收(Cyclical packaging rescue,CPR)技术进行肝癌细胞耐药基因的筛选即是通过病毒包装将基因从细胞中钓取出来,相比于常规筛选方法,仅通过一轮筛选可能会出现很多假阳性基因,采用CPR技术则是通过多轮筛选,很大程度减少了假阳性细胞的出现。通过该方法经过四轮筛选获得核糖体蛋白S11(RPS11)、核糖体蛋白L6(RPL6)、核糖体蛋白L11(RPL11)、核糖体蛋白L24(RPL24)等几种基因,经初步检测,增加了细胞的耐药性。     

骨形成蛋白10成熟肽在大肠杆菌中的表达纯化及活性分析

目的:以生物制备骨形成蛋白10(BMP10)为目标,研究BMP10成熟肽在大肠杆菌中的表达及活性。方法:以人源BMP10成熟肽基因为模板,PCR获得N端带有组氨酸标签(6×His)的融合基因6×His-m BMP10,构建p ET28a/m BMP10表达载体;热击转染大肠杆菌BL21(DE3)菌株,卡那霉素抗性筛选获得重组表达菌株BL21/p ET28a-6×His-m BMP10,IPTG诱导表达后利用SDS-PAGE电泳、Western印迹对蛋白进行分析;超声波破碎菌体,收集包涵体,镍柱亲和层析纯化获得电泳纯目的蛋白;透析复性后,非还原SDS-PAGE检验目标蛋白的二聚体形成;通过体外细胞实验检测蛋白活性。结果:纯化得到纯度90%以上的m BMP10,复性后二聚体得率约为40%;活性实验测得P19细胞的Smad6蛋白表达上调3倍左右。结论:通过大肠杆菌表达体系获得具有生物活性的BMP10,为后续作用机理研究奠定了实验基础。