脂环酸芽孢杆菌D-1的耐盐内切葡聚糖酶基因克隆、表达与酶学性质北大核心CSCD

【目的】克隆温泉中嗜热嗜酸的脂环酸芽孢杆菌D-1(Alicyclobacillus tengchongensis CGMCC1504)的内切葡聚糖酶基因gluE1,并对该酶进行序列分析和重组酶的酶学特性分析。【方法】通过全基因组测序获得gluE1全长,并对其氨基酸序列(GluE1)进行分析。将gluE1重组到载体p EASY-E2中并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达,利用组氨酸标签纯化GluE1并进行酶学性质分析。【结果】gluE1与NCBI数据库中GH5的内切葡聚糖酶具有较高的相似性,全长1020 bp,GC含量50.5%,编码339个氨基酸(40.45 k Da)。GluE1与数据库中序列的最高一致性为97%,与其余纤维素酶的一致性<60%。GluE1可水解CMC-Na、可溶性淀粉和大麦β-葡聚糖,表观最适pH为6.5,pH 5.0–10.0稳定并维持60%以上的酶活性。GluE1的表观最适温度为55℃,在37℃下稳定。在55℃ pH 6.5条件下,GluE1对大麦β-葡聚糖的K_m、V_(max)和k_(cat)分别为8.58 mg/mL、416.67 U/mg和280.90 s^(–1)。GluE1受Ag^+、Hg^(2+)及SDS抑制,β-巯基乙醇、Pb^(2+)、Mg^(2+)、Ca^(2+)和Na^+对GluE1有微弱的促进作用,NaCl对GluE1的影响不大,加入30%的NaCl,仍有64%以上的酶活性;经30%的NaCl在37℃下处理60 min,仍能保持93%以上的活性。【结论】首次报道从Alicyclobacillus属的细菌中克隆得到内切葡聚糖酶基因并对其酶学性质进行研究,GluE1具有良好的pH稳定性和有较强的耐盐性,可能具有更大应用潜力。     

滇金丝猴粪便微生物来源的β-半乳糖苷酶基因的表达及酶学性质

【目的】对滇金丝猴粪便微生物来源的β-半乳糖苷酶进行异源表达和纯化,并研究其酶学性质。【方法】从滇金丝猴粪便微生物的宏基因组中克隆出一个β-半乳糖苷酶基因galRBM20_1,对该基因进行异源表达和酶学性质分析。构建含有T7强启动子的pEASY-E2-galRBM20_1质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行酶学性质研究。【结果】滇金丝猴粪便来源的β-半乳糖苷酶(galRBM20_1)最适pH为5.0,在pH 4–7之间能保留70%及其以上的活性。最适温度为45°C,在37°C和45°C下耐受1 h,酶活不变。特别的是,该酶具有良好的Na Cl稳定性,经1–5 mol/L的Na Cl作用1 h后,相对酶活均能超过初始酶活:当NaCl的作用浓度为4 mol/L时,β-半乳糖苷酶相对酶活最高(146%);当NaCl的作用浓度为5mol/L时,β-半乳糖苷酶的相对酶活仍达到135%。【结论】本研究从滇金丝猴粪便微生物的宏基因库中克隆得到β-半乳糖苷酶基因galRBM20_1,并成功在大肠杆菌BL21(DE3)表达,首次从动物胃肠道宏基因组中获得具有耐盐和转糖基产Galactooligosaccharides(GOS)性能的β-半乳糖苷酶。该酶具有良好的耐盐性,和较广的pH作用范围,使其在食品、生物技术领域和环保方面的发展具有良好的应用价值。     

发酵工程实验教学改革初探

发酵工程作为生物工程专业学生的必修课程,是一门实践性极强的学科。为了在发酵工程实验教学中训练学生科学的思维和方法、培养适合于社会需求的创新型、综合型人才,在发酵工程实验课程内容、教学方法和考核方式等方面进行了初步改革,并取得了较好的效果。     

倭蜂猴粪便微生物苯酚羟化酶和邻苯二酚1,2-双加氧酶基因多样性研究

【目的】分析倭蜂猴粪便微生物中苯酚羟化酶(Phenol hydroxylase,PH)和邻苯二酚1,2-双加氧酶(Catechol 1,2-dioxygenase,C12O)的基因多样性。【方法】利用简并引物,以倭蜂猴粪便微生物宏基因组DNA为模板,通过PCR扩增,分别构建PH和C12O基因克隆文库,并对克隆进行测序分析。【结果】倭蜂猴粪便微生物来源的PH和C12O基因序列经BLAST比对分析,与GenBank中相应酶的序列一致性分别介于92%?100%和87%?100%。系统进化树分析表明PH基因序列与Neisseria、Burkholderia、Alcaligenes、Acinetobacter 4个属来源的PH序列相关;C12O基因序列全部与Acinetobacter来源的C12O序列相关。序列比对结果表明PH序列具有LmPH (Largest subunit of multicomponent PH)中高保守的两个DEXRH结构域;C12O序列具有能被Ag+和Hg2+抑制的位点(半胱氨酸)。【结论】倭蜂猴粪便微生物来源的PH为多组分PH,其降解苯酚的中间产物邻苯二酚可以被C12O通过邻位开环途径裂解。     

发酵工程实验教学改革初探

发酵工程作为生物工程专业学生的必修课程,是一门实践性极强的学科。为了在发酵工程实验教学中训练学生科学的思维和方法、培养适合于社会需求的创新型、综合型人才,在发酵工程实验课程内容、教学方法和考核方式等方面进行了初步改革,并取得了较好的效果。     

双波长法测定二元混合体系中戊糖的含量

目的:针对单波长法在测定己糖和戊糖的混合体系中戊糖含量时出现较大的误差,提出了等吸收双波长法测定二元混合体系中戊糖的含量.方法:通过对己糖(葡萄糖)和戊糖(木糖)的不同含量(5-150μg/体系)与显色剂反应产物在不同波长(500,～700nm)条件下吸光曲线以及显色剂本身吸光曲线进行综合考虑,确定双波长,并对单双波长法测定同样样品的回收率进行了比较分析.结果:确定的测定波长为670nm,参比波长为580nm,双波长法建立的标准曲线方程为:Y=0.0056x-0.0123(y为两个波长下吸光度的差值,x为木糖的含量(μg)).R2=0.9995,线性范围为5-30μg/体系.单波长法对标样和试样的平均回收率分别为116%±15%和89%±13%;双波长法对标样和试样的平均回收率为104%±4%和95%±11%.结论:与单波长和一些其他方法相比,双波长法测定混合体系中戊糖含量较为简便易行且可以提高准确度.     

大鼠子宫内膜异位模型的建立与组织学观察

目的为开发诊治子宫内膜异位症(endometriosis,EMT)的新药研究提供理想的动物模型。方法取雌性未交配性成熟大鼠,术前雌激素诱导,麻醉开腹取部份右侧子宫,将内膜种植于左腹壁内,术后16周取出包块,进行组织形态学、组织化学观察。结果异位内膜在腹壁内生长,呈隆起囊状小包块,内有黏液,具有正常子宫内膜基本组织结构,囊腔较大。异位内膜中有糖原、RNA的存在。结论该手术方法建立的子宫异位内膜生长良好,术后一周就可摸及包块大小,为开发研究子宫内膜异位症的新药提供了方便。     

深化发酵工程实验教学改革适应基础教育新课改

高师院校发酵工程实验教学必须服务于基础教育的实施, 把培养学生的创新精神和实践能力放在首位。因此, 基础教育新课程改革背景下的发酵工程实验教学改革应从课程内容入手, 改革教学方法、培养方式和评价体系, 以达到培养高师学生科研能力、工作态度、创新能力和从教能力的目的。     

粪便微生物宏基因组来源GH1 β-葡萄糖苷酶的重组表达及酶学性质

【背景】β-葡萄糖苷酶是一类重要的纤维素分解酶类。目前较多可培养微生物来源的β-葡萄糖苷酶(Bgl)存在热稳定性和酸碱稳定性差及作用范围窄的问题。【目的】从滇金丝猴粪便微生物宏基因组中挖掘新型β-葡萄糖苷基因,异源表达并研究其酶学性质,为食品等领域提供新型酶资源。【方法】从粪便微生物宏基因组出发,扩增和异源表达β-葡萄糖苷酶基因BglRBS₂6和BglRBS₉,并进行酶学性质研究。【结果】获得GH1家族重组β-葡萄糖苷酶BglRBS₂6和BglRBS₉,分子量分别为60 kD和50 kD。BglRBS₂6的最适作用条件为pH 6.0、45℃;BglRBS₉的最适作用条件为p H 5.0、40°C。Bgl RBS₂6和Bgl RBS₉的Km分别为(0.681 6±0.164 2)μmol/L和(3.317 0±0.871 4)μmol/L。BglRBS₂6具有较好的酸碱耐受性,在pH 5.0–...     

胃肠道微生物及其分子生态学技术研究进展

由于与人类健康和疾病密切相关,胃肠道微生物研究已成为当今的热点研究领域。目前研究的分子手段已经从单纯的分析微生物群落结构组成,发展到通过宏转录组学、宏蛋白组学和代谢组学等"组学"技术揭示胃肠道微生物群落的相应功能。本文结合我们的研究工作,综述了国内外胃肠道微生物及其分子生态学技术的研究进展。