运用BioID技术筛选水稻GS3互作蛋白

水稻异源三聚体G蛋白系统中的非典型γ亚基GS3,是一个控制籽粒大小的主效数量效应基因座,在调节籽粒大小中发挥负调控因子的功能。BioID(proximity-dependent biotin identification)为邻近蛋白标记技术,其工作原理是生物素连接酶能使其周围的蛋白带上生物素,同时生物素又能和链霉亲和素紧密结合,所以能够利用链霉亲和素偶联的磁珠富集目标蛋白。该技术具有灵敏、高效和周期短等特点,为筛选互作蛋白提供了新方法。为了解析GS3的蛋白调控网络,该研究以水稻原生质体为材料,采用BioID技术对GS3在水稻中的互作蛋白进行了筛选。Western-blot结果表明:融合蛋白Bir AG-GS3在原生质体中成功表达并生物素化GS3邻近蛋白。使用链霉亲和素磁珠富集生物素化后的蛋白,并进行蛋白质谱测序,获得了与GS3邻近的可能存在直接或间接互作的蛋白。将获得的蛋白进行功能富集与注释,并构建蛋白-蛋白互作网络。对部分蛋白进行了BiFC验证,发现GS3可能与ICL、PPDK、RPN7和RH15发生相互作用,涉及能量代谢的调节、种子淀粉物质的储存、泛素-蛋白酶体系统以及凋亡途径等生物过程。     

采用CELⅠ酶粗提物高效鉴定CRISPR/Cas9介导的基因突变

CRISPR/Cas9是新兴的基因组编辑技术,该技术操作简单、效率高,已成为目前最主流的基因组编辑技术。利用该技术进行突变体创制,对基因功能研究和育种应用具有重要的意义,而快速、高效、低成本的基因编辑个体鉴定是其中的重要环节。本研究对影响CELⅠ粗提物鉴定CRISPR/Cas9介导的水稻基因编辑个体的条件,包括蛋白用量及作用时间、PCR反应缓冲液等条件进行了探索,并将整个检测体系集成于一管操作。同时,采用CELⅠ粗提物检测了CRISPR/Cas9介导水稻stn1突变的T_0代植株及后代,对杂合突变、纯合突变及双等位突变的鉴定策略进行了探讨;该方法检测正确率经测序验证达100%。上述结果表明,采用CELⅠ粗提物检测突变体与已有方法比较具有廉价、快速和高效的特点。